超螺旋質(zhì)粒dna純化工藝的研究

超螺旋質(zhì)粒dna純化工藝的研究

自20世紀(jì)90年代美國威斯康興大學(xué)的wolff教授發(fā)現(xiàn)dna可直接誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并提出以科學(xué)家為基礎(chǔ)的新疫苗。核酸疫苗具有安全性高和操作簡便等優(yōu)點(diǎn),因此逐漸成為預(yù)防、治療和診斷癌癥、艾滋病等疾病的重要手段之一。然而,獲得大量高純度的質(zhì)粒DNA比較困難,且超螺旋質(zhì)粒DNA純度需達(dá)到90%以上。本研究采用Sepharose6FF去除RNA,避免了應(yīng)用RNaseA所造成的動(dòng)物源性酶類污染及需要去除等不便,再應(yīng)用PlasmidSelectXtra去除線性質(zhì)粒DNA,經(jīng)SOURCE30Q精提,獲得高純度質(zhì)粒DNA,為大規(guī)模制備基因治療用質(zhì)粒DNA奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1.材料和方法1.1-btbl-ox40l質(zhì)粒pVAXI-MEG-p24-4-1BBL-OX40L由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所病毒室構(gòu)建并保存;大腸桿菌JM109由該所保存。1.2儀器和檢測方法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒購自湛江安度斯生物有限公司;BCA蛋白檢測試劑盒購自海門碧云天生物技術(shù)研究所;AKTAExplorer100液相色譜儀及QuixStand中空纖維交叉流過濾系統(tǒng)、Sepharose6FF凝膠、PlasmidSelectXtra和SOURCE30Q均購自美國GE公司;核酸蛋白檢測儀購自美國Pharmacia公司;酶標(biāo)儀購自美國Awareness公司;PCR擴(kuò)增儀(GeneAmpPCRSystem9600)為PERKIN-ELMER公司產(chǎn)品。1.3s1293—細(xì)菌發(fā)酵無菌條件下,將質(zhì)粒pVAXI-MEG-p24-4-1BBL-OX40L轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109。挑取單個(gè)菌落,接種至4mlLB培養(yǎng)液(含50μg/ml卡那霉素)中,37℃,250r/min振搖培養(yǎng)至A≈0.6,再接種至1LLB培養(yǎng)液(含50μg/ml卡那霉素)中,37℃,250r/min揺床培養(yǎng)16h作為發(fā)酵菌種,以同樣的方法培養(yǎng)5份菌體備用。1.4過濾層濃縮條件采用QuixStand中空纖維交叉流過濾系統(tǒng)搜集菌體,纖維柱型號(hào)為CFP-2-E-4X2MA(孔徑0.2μm,纖維管內(nèi)徑1mm,濾膜面積0.085m2,濾柱流道長度60cm),濃縮條件為TMP:1psi,flux:60LMH。將5L菌體濃度為2%的菌液濃縮至170ml(菌體濃度約60%),用時(shí)1h。1.5洗滌液的配置采用溶液Ⅰ(25mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,50mmol/LGlucose,pH8.0)作為洗滌液,并逐漸替換培養(yǎng)液。用堿裂解法裂解菌體,將回收換液后的菌液加入340ml溶液Ⅱ[200mmol/LNaOH,1%(w/v)SDS]中,混勻后冰浴5min,立即加入255ml溶液Ⅲ(3mol/LKOAc,5mol/LCH3COOH),充分振蕩,冰浴30min,用200目濾網(wǎng)過濾,去除雜質(zhì),保留濾液。1.6纖維管/濾膜濃縮采用型號(hào)為UFP-300-E-4X2MA的中空纖維柱(孔徑300000NMWC,纖維管內(nèi)徑1mm,濾膜面積0.085m2,濾柱流道長度60cm)濃縮,濃縮條件為TMP:17psi,flux:25LMH。將765ml裂解液濃縮至150ml(約5倍濃縮),用時(shí)1h。1.7壓力裝柱法結(jié)果按照GE公司說明書方法裝柱,利用AKTA色譜系統(tǒng)恒流速壓力裝柱法完成,最終各柱的柱床體積分別為:凝膠層析柱392ml,柱高20cm;親和層析柱20ml,柱高10cm;離子交換層析柱20ml,柱高10cm。1.8優(yōu)質(zhì)粒dna的純度1.8.1平衡柱床流采用Sepharose6FF去除RNA,用5×CV溶液A[2.1mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]平衡柱床(流速10ml/min)。將濃縮的裂解液按10ml/min的流速上樣,以10ml/min的流速用溶液B[2.0mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]洗脫。1.8.2nacl-pcr法純化質(zhì)粒dna1.6cm×10cm層析柱內(nèi)裝填體積壓積(CV)為20ml的PlasmidSelectXtra,用5×CV溶液C[0.3mol/LNaCl,1.7mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]平衡柱床(流速4ml/min)。將第一步收集的純化質(zhì)粒DNA按流速4ml/min上樣后,以4ml/min的流速用溶液B洗脫,將線性質(zhì)粒DNA洗脫除去。以3.5ml/min的流速用溶液C洗脫,收集超螺旋質(zhì)粒DNA。1.8.3純化樣品的制備1.6cm×10cm層析柱內(nèi)裝填CV為20ml的SOURCE30Q,用5×CV溶液D(0.4mol/LNaCl,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5)平衡柱床(流速4ml/min)。確定上一步收集的純化樣品體積,以2倍體積的H2O稀釋,將稀釋的樣品按4ml/min的流速上樣,并確保樣品的電導(dǎo)率高于溶液D。繼續(xù)以4ml/min的流速用溶液D洗脫,將雜質(zhì)除去。最后以4ml/min的流速用溶液E(1.0mol/LNaCl,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5)洗脫,收集超螺旋質(zhì)粒DNA。1.9對純粒dna的檢測1.9.1瓊脂糖凝膠電泳分析用含0.5μg/ml溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳分析洗脫樣品成分,電泳結(jié)束后,置凝膠成像儀紫外燈下成像并拍照。1.9.2dna純度檢測根據(jù)洗脫樣品電泳結(jié)果,將質(zhì)粒DNA收集管樣品混合,于核酸蛋白檢測儀260nm波長處測定A值,以A260/280表示質(zhì)粒DNA的純度。1.9.4檢測內(nèi)毒素含量參照使用說明書,用終點(diǎn)顯色法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素含量。1.9.5pcr檢測試驗(yàn)按照文獻(xiàn)方法,挑取單個(gè)大腸桿菌JM109菌落,接種于4mlLB培養(yǎng)液中,培養(yǎng)16h后,小量提取質(zhì)粒,作為染色體DNAPCR陽性對照,取2μl待檢樣品用于檢測。根據(jù)DNAsis軟件分析大腸桿菌染色體序列,選取保守的RNaseR基因中的460bp作為擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物為:5′-atggcttctgtcaacgctgtt-3′;下游引物為:5′-aaaactgcctggcacagcaatt-3′。PCR反應(yīng)條件為:95℃5min;94℃30s,55℃40s,72℃90s,30個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。2.結(jié)果2.1優(yōu)質(zhì)粒dna的純度2.1.1收峰的測定用B液作為洗脫液,在層析圖譜上可見2個(gè)吸收峰,見圖1。電泳結(jié)果表明,RNA得到有效分離,并且通過Sepharose6FF可以去除部分線性質(zhì)粒DNA,見圖2。2.1.2超螺旋質(zhì)粒dna峰用B液作為洗脫液,出現(xiàn)第1個(gè)吸收峰即線性質(zhì)粒DNA峰,待吸收曲線趨于平穩(wěn)后,用C液作為洗脫液,出現(xiàn)第2峰即超螺旋質(zhì)粒DNA峰,見圖3。電泳結(jié)果表明,PlasmidSelectXtra凝膠可有效除去樣品中的松弛型及線性質(zhì)粒DNA,見圖4。2.1.3質(zhì)粒dna用溶液D洗脫去除雜質(zhì),再以溶液E洗脫,收集超螺旋質(zhì)粒DNA,見圖5。電泳結(jié)果表明,所收集的超螺旋質(zhì)粒較純,經(jīng)掃描分析,超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒達(dá)到樣品總質(zhì)粒的91.2%,經(jīng)ClaⅠ酶切鑒定結(jié)果正確,見圖6。2.2對純粒dna的檢測2.2.1純度2.2.2蛋白質(zhì)殘?jiān)肂CA檢測試劑盒幾乎檢測不到蛋白質(zhì)殘留(-2.62mg/ml),表明質(zhì)粒DNA中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)被有效去除。2.2.3內(nèi)毒素含量2.2.4剩余的胎盤dna文件3.超濾系統(tǒng)與離子篩層析分離質(zhì)粒sec近年來,防治各種疾病的核酸疫苗不斷問世,需要摸索出一套成熟的適合大規(guī)模生產(chǎn)的質(zhì)粒DNA純化技術(shù),以適應(yīng)未來疫苗的發(fā)展。同時(shí),國家食品藥品監(jiān)督管理局也頒布了《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,提出產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下:超螺旋質(zhì)粒純度大于90%;宿主蛋白殘留量小于0.001μg/μg;殘余宿主DNA含量不超過0.002μg/μg;瓊脂糖凝膠電泳未見明顯條帶;內(nèi)毒素含量小于10EU/μg;總純度(A260/A280)大于1.75;鑒別試驗(yàn)經(jīng)酶切電泳后符合酶切圖譜。本實(shí)驗(yàn)采用中空纖維超濾系統(tǒng)回收菌體,該系統(tǒng)與其他形式的平面膜過濾系統(tǒng)相比較,具有超濾膜孔徑小、液體流動(dòng)的剪切力大、過濾時(shí)不易產(chǎn)生濃差極化等優(yōu)點(diǎn),提高了過濾效果,而且可以去除部分RNA。實(shí)驗(yàn)表明,使用中空纖維超濾系統(tǒng)可以完全替代離心機(jī)收菌,用離心機(jī)收菌生產(chǎn)設(shè)備成本高,生產(chǎn)周期長,而且生產(chǎn)過程易于污染。以往濃縮質(zhì)粒主要靠透析來完成,這種方法主要的弊端是透析時(shí)間長,透析的量少,且操作繁瑣易污染,透析時(shí)間不好掌握,質(zhì)粒損失大,回收率低,不適合大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用中空纖維柱濃縮質(zhì)粒,速度快,質(zhì)粒損失少,適合用于大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用三步柱層析法進(jìn)行質(zhì)粒的純化,即分子篩層析、親和層析及離子交換層析。分子篩層析(SEC)是利用質(zhì)粒DNA的大小和構(gòu)象進(jìn)行分離純化,可單獨(dú)使用,也可在離子交換等其他層析步驟之后應(yīng)用。SEC可去除gDNA和RNA等雜質(zhì)污染,也可降低內(nèi)毒素含量。本實(shí)驗(yàn)采用Sepharose6FF作為分子篩填料進(jìn)行分離純化,結(jié)果去除了幾乎全部RNA,給生產(chǎn)帶來了極大的便利。傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA純化工藝中,去除RNA的方法是加入牛RNase來降解RNA,既增加了成本,又有傳播瘋牛病的風(fēng)險(xiǎn),另外還需在純化工藝中增加去除RNase的純化步驟,增加了純化成本,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。親和層析是利用超螺旋構(gòu)型的質(zhì)粒的親和力比對松弛異構(gòu)體的親和力高而進(jìn)行分離純化的,從電泳結(jié)果看,分離效果較理想,該柱也具有去除內(nèi)毒素的作用。離子交換層析是根據(jù)混合物中不同分子所帶電荷性質(zhì)的差異進(jìn)行分離純化的一種層析技術(shù),在純化目的分子的同時(shí),可去除內(nèi)毒素和雜質(zhì)[9~11]。從檢測結(jié)果看,所有檢測指標(biāo)均符合并高于國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述,該套純化工藝操作簡易,柱再生能力強(qiáng),質(zhì)?；厥章矢?適用于大規(guī)