連黃對(duì)大腸埃希菌多重耐藥基因acramrna表達(dá)的影響

連黃對(duì)大腸埃希菌多重耐藥基因acramrna表達(dá)的影響

現(xiàn)在，通過提高細(xì)菌膜外輸出泵的生產(chǎn)水平，可以主動(dòng)將藥物或其他外離出冒出細(xì)菌細(xì)胞的污染物釋放到細(xì)菌細(xì)胞，從而獲得細(xì)菌非特異性耐藥性。大腸桿菌(Escherichiacoli)是畜禽的重要致病菌,也是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵。一般認(rèn)為AcrAB-TolC是大腸桿菌主要的外輸泵。本試驗(yàn)用中藥復(fù)方制劑連黃(精提,粗提)作用于多重耐藥大腸埃希菌,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)中藥連黃(精提,粗提)作用前后AcrA基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了對(duì)比分析,檢測(cè)復(fù)方中藥對(duì)大腸埃希菌耐藥性的影響與AcrA基因的mRNA表達(dá)水平的關(guān)系,為中藥制劑的全面開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒敏感大腸埃希菌K88由韓國(guó)國(guó)立獸醫(yī)科學(xué)檢疫院提供,耐藥大腸埃希菌NUT及多重耐藥大腸埃希菌DL1由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.3ker研究項(xiàng)目主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;總RNA提取試劑盒、TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒等為寶生物工程(大連)有限公司和北京華美公司共同提供。1.1.4實(shí)時(shí)熒光定量pcr設(shè)備主要有T1PCR儀(德國(guó)Biometra公司)、GeIDoc-IT數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Sim公司)、3-18k低溫高速離心機(jī)(武漢力博遠(yuǎn)志科技有限公司)、Y1-1450-1S無(wú)菌超凈工作臺(tái)(山東濟(jì)南天方凈化設(shè)備工程公司)、UV-722可見光分光光度計(jì)(上海亞研電子科技有限公司)、Ling-gene實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(杭州大和熱磁電子有限公司)等。1.2測(cè)試方法1.2.1引物的引物從GenBank中查到大腸桿菌AcrA基因的序列,借助計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物,引物由上海英駿生物有限公司合成。上游引物為:5′GACGACAAACAGGCCCAACA3′,下游引物為:5′TTAAGACTTGGACTGTTCA3′。以提取的多重耐藥大腸埃希菌的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物純化,把回收的PCR擴(kuò)增目的片段與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆、HindHI和EcoⅠ酶切鑒定,同時(shí)進(jìn)行PCR鑒定。1.2.2在中藥復(fù)方制劑的作用前后，acra總nale活性物質(zhì)的制備根據(jù)TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書提取大腸桿菌的總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。1.2.3不同堿基絕對(duì)模板數(shù)量已知pMD18-T載體長(zhǎng)2692bp,插入的AcrA片段長(zhǎng)為1005bp,每個(gè)堿基的相對(duì)分子質(zhì)量為330bp,阿弗加德羅常數(shù)為6.02×1023/mol。通過公式計(jì)算出每2μL的絕對(duì)模板數(shù)量(質(zhì)粒含量)是1.5×1017。每個(gè)樣品分別設(shè)2個(gè)重復(fù),取等比10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品1μL進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。1.2.4fluo-pcr和上、下游pcr的配比利用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)參考模板和待測(cè)的靶序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。體系如下:HotstartFluo-PCRmix混合物25μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,用去離子水補(bǔ)至50μL。條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,60℃退火45s,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán)。2結(jié)果與分析2.1pc的目的片段提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增,得到了大小為1005bp大小的目的片段;篩選出陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行酶切及PCR鑒定,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,結(jié)果表明,得到的堿基序列完全正確(圖1)。2.2測(cè)試對(duì)象序列的制備對(duì)提取的耐藥大腸桿菌總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均可見到1005bp大小的特異性片段,說明反轉(zhuǎn)錄成功。2.3確定ct值選取相當(dāng)于1.5×1011、1.5×1012、1.5×1013、1.5×1014、1.5×1015、1.5×1016拷貝/μL6個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒DNA液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,擴(kuò)增結(jié)果見圖2。調(diào)整閾值和基線的配比,確定CT值,經(jīng)轉(zhuǎn)換得出標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌濃度的log值,縱坐標(biāo)為Rea1-timePCR測(cè)得的CT值。斜率為-2.516,截距為39.390,將測(cè)得的CT值代入公式,可以計(jì)算出待測(cè)樣品中的拷貝數(shù)。對(duì)相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998以上的可以作為檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。由圖中可見,所選的標(biāo)準(zhǔn)濃度呈現(xiàn)出良好的S型擴(kuò)增曲線,表明各濃度梯度均可在35個(gè)循環(huán)前獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果,且產(chǎn)物特異性強(qiáng),產(chǎn)物的Tm值非常均一,說明引物的靈敏度高,其反應(yīng)性完全可以滿足進(jìn)行SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR的要求。2.4中藥復(fù)方制劑對(duì)大鼠埃希菌的作用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,可得待測(cè)模板的cDNA量,結(jié)果見表1。由表1可知,中藥復(fù)方制劑連黃(精提、粗提)作用后,大腸埃希菌多重耐藥基因AcrA的mRNA表達(dá)量均有所降低,與作用之前比均差異顯著(P<0.05),且精提制劑降低的程度更明顯,與粗提制劑相比,差異極顯著(P<0.01)。3中藥復(fù)方制劑連黃后樣品的測(cè)定1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR方法基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法,它融匯了PCR靈敏性和光譜技術(shù)精確性的特點(diǎn),是基因表達(dá)分析最常用的方法之一,其包括了絕對(duì)定量和相對(duì)定量。本研究采用絕對(duì)定量的方法,把待測(cè)基因克隆到pMD18-T載體上,該載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、定量準(zhǔn)確,并且制備方便、價(jià)廉,可以得到樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度。試驗(yàn)采用倍比稀釋方法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線,最大程度地保證了標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的同一性,使結(jié)果準(zhǔn)確可信。2)本研究通過對(duì)中藥復(fù)方制劑連黃作用前后各大腸埃希菌多重耐藥基因AcrA的mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較分析后可知,經(jīng)中藥復(fù)方連黃亞抑菌濃度作用后的大腸埃希菌多重耐藥基因AcrA的mRNA表達(dá)量,均低于其相對(duì)應(yīng)的中藥作用前AcrA的mRNA表達(dá)量,并且精提制劑的降低程度更明顯。3)大腸埃希菌產(chǎn)生多重耐藥性主要與AcrAB外排系統(tǒng)有關(guān),AcrAB外排系統(tǒng)包括3個(gè)成分,分別是周質(zhì)融合蛋白AcrA、外排轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB和多功能外膜蛋白TolC。3個(gè)成分通過協(xié)調(diào)配合,主動(dòng)將菌體內(nèi)的抗菌物質(zhì)泵出細(xì)胞外;如果使該系統(tǒng)失活,則菌株即從多重耐藥狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾袪顟B(tài)。因此抑制AcrAB外排系統(tǒng)的活性或降低其表達(dá)水平,均可使細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力及抗生素耐藥水平下降。本試驗(yàn)說明,中藥復(fù)方制劑連黃(精提、粗提)的抑菌作用可能是通過降低AcrAB外排系統(tǒng)