代謝組學(xué)技術(shù)在生物樣品檢測中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)在生物樣品檢測中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是經(jīng)過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)換組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)而發(fā)展起來的一門新興學(xué)科。采用先進的工具分析方法、高靈敏度和高分辨率的現(xiàn)代方法，結(jié)合評價和其他化學(xué)計量學(xué)方法，研究生物系統(tǒng)（細(xì)胞、組織或生物）的激活或干擾（例如，在特定基因變異或環(huán)境變化后）下代謝產(chǎn)物的變化或隨著時間的推移而變化。所謂代謝組是基因組的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物,是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長發(fā)育的小分子化合物的集合。通常,代謝組學(xué)研究的對象并非某些特定的物質(zhì),而是要盡可能多地獲取所有代謝產(chǎn)物的信息。而分析對象的大小、數(shù)量、官能團、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率等物理化學(xué)參數(shù)的差異對分析結(jié)果影響極大。現(xiàn)有的主要檢測手段包括:核磁共振技術(shù)(NMR)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE-MS)以及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。其中與CE-MS、LC-MS或LC-NMR等分析儀器相比,GC-MS儀器中經(jīng)氣相色譜柱分離后的樣品呈氣態(tài),流動相也是氣體,與質(zhì)譜的進樣要求相匹配,最容易將這兩種儀器聯(lián)用;它具有靈敏度高、分離效率高、易用、耐用、成本低、可選擇性地分離和檢測大量痕量代謝物質(zhì)和同質(zhì)異構(gòu)體等優(yōu)點。由于其高標(biāo)準(zhǔn)化地應(yīng)用了電子電離,能產(chǎn)生廣泛的和高重復(fù)性的破裂片段,即使得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中不存在,其破碎模式亦可用于獲得更多關(guān)于代謝產(chǎn)物定性或化合物種類的信息。故GC-MS已成為代謝組學(xué)中廣泛應(yīng)用的重要分析方法,目前發(fā)展也較為成熟,是復(fù)雜混合物分析的主要定性和定量手段之一。1gc-ms聯(lián)合技術(shù)介紹1.1全掃描和選擇離子掃描按照質(zhì)譜技術(shù),GC-MS聯(lián)用技術(shù)通常有氣相色譜-四級桿質(zhì)譜或磁質(zhì)譜(GC-MS)、氣相色譜-離子阱質(zhì)譜(GC-ITMS)、氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC-TOFMS)。四級桿質(zhì)譜儀掃描方式又有全掃描和選擇離子掃描(SIM)之分,全掃描是對指定質(zhì)量范圍內(nèi)的離子全部掃描并記錄,得到的質(zhì)譜圖可以提供未知物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息。而SIM方式僅對選定的離子進行檢測,可消除樣品中其他組分造成的干擾,檢測靈敏度、選擇性極強,主要用于對具有某種特性的代謝物進行定量分析。TOFMS提供了更快的掃描率和額外的敏感性,采集到的每一個數(shù)據(jù)點都對應(yīng)一個完整的質(zhì)譜圖,檢測揮發(fā)性化合物的能力比四級桿質(zhì)譜強,在目前代謝組學(xué)的研究中應(yīng)用最為普遍。ITMS結(jié)構(gòu)小巧,能在極低壓強下長時間儲存離子,因此對真空泵的要求降低,從而減輕質(zhì)譜儀重量和電源消耗,更加便于小型化設(shè)計,故其應(yīng)用也越來越廣泛。1.2衍生化衍生物檢測GC-MS一般用于測定包括氨基酸、胺、脂肪酸、有機酸、糖、糖胺、糖磷酸、嘌呤、嘧啶和芳香族化合物在內(nèi)的代謝物,其檢測限一般為信噪比(S/N)=3∶1時的濃度。但這些代謝物的極性強、揮發(fā)性低,往往不能直接進樣分析,需要將這些物質(zhì)進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物,才能適用氣相色譜的測定范圍,衍生化的過程同時能改善結(jié)構(gòu)及其近似化合物分離的選擇性,克服載體、柱壁對高極性、低揮發(fā)性樣品的吸附,從而有效改善樣品的峰形,此外選擇特殊的衍生化方法還可用來拆分某些較難分離的手性化合物。在GC-MS檢測中選用衍生化試劑需注意衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜特性,即質(zhì)量碎片的特征性強,同時分子量要適中,既適合質(zhì)量型檢測器檢測,也有利于與基質(zhì)干擾物分離。常用的衍生化試劑分為硅烷化、酰化和烷基化三類,其反應(yīng)原理及優(yōu)缺點見表1,其中應(yīng)用最廣泛的是硅烷化試劑和?；噭?gc-ms定量分析的穩(wěn)定性自1957年實現(xiàn)GC-MS聯(lián)用以來,該技術(shù)得到了迅速發(fā)展。由于其能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度,并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫,可方便地得到待分析代謝物的定性結(jié)果。它在生命科學(xué)中的應(yīng)用,使我們能在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上更好地描述和評估生命系統(tǒng)。由于GC-MS分析的變異性取決于以下三個方面:1)分析方法(色譜、檢測和衍生化樣品的穩(wěn)定性);2)樣品制備(淬滅、提取和濃縮);3)樣品的變異性。因此,為保證分析方法的線性、準(zhǔn)確性、靈敏度及穩(wěn)定性,應(yīng)根據(jù)研究對象、目的和分析化合物的不同,對預(yù)處理過程及分析方法進行全面的評估與優(yōu)化,以確定利用GC-MS進行代謝物分析的最佳方法。Zhang等在利用GC-TOFMS對高血脂老鼠的尿液進行代謝組學(xué)分析時,從分離鑒定出的代謝物中,選取有機酸、氨基酸、碳水化合物等代表性物質(zhì)進行方法驗證,以保證定量分析的準(zhǔn)確性。2.1不同提取方法對細(xì)胞代謝及代謝特性的影響利用GC-MS分析生物體內(nèi)的代謝物,需要對樣品進行預(yù)處理及衍生化,預(yù)處理過程主要包括代謝淬滅、細(xì)胞濃縮、代謝物提取等。為獲取微生物具有代表性的樣品,分析時樣品的代謝組成分必須保證與取樣時一致,才能反映樣品當(dāng)時的代謝活動,因此這一反映特定生理狀態(tài)的代謝狀態(tài)必須要被“固定”住,直到分析完成,該過程稱為淬滅。由于不同微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同,對滲透壓的耐受程度以及膜通透性也存在差異,因此代謝淬滅所選擇的方法也無法統(tǒng)一。目前報道的淬滅方法中,冷甲醇淬滅方法溫和,且可通過離心富集細(xì)胞,在多種微生物代謝物檢測中廣泛應(yīng)用,但不同的菌株所采用的甲醇濃度差異較大(表2)。離心后的沉淀物中不但包含菌體和細(xì)胞內(nèi)液,還混有細(xì)胞間液。這些細(xì)胞間液包含了培養(yǎng)基成分及細(xì)胞外代謝產(chǎn)物,若沉淀物經(jīng)過提取后細(xì)胞內(nèi)/外液無法區(qū)別,將影響對胞內(nèi)代謝物的準(zhǔn)確檢測。故提取前仔細(xì)洗滌菌體沉淀將有助于排除混有細(xì)胞間液所產(chǎn)生的干擾,但是缺點是容易使一些自由出入細(xì)胞膜的組分(如小分子有機酸)濃度降低并容易導(dǎo)致細(xì)胞破碎。因此,在細(xì)胞濃縮過程中既要做到除去細(xì)胞間液也要減少胞內(nèi)代謝物的損失。代謝物提取以盡可能多地獲得所需物質(zhì),避免物理或化學(xué)改性,減少稀釋效應(yīng)為原則。Maharjan等采用酸堿破壞、冷甲醇破壁、甲醇或乙醇高溫提取、氯仿-甲醇溶菌提取等6種不同的方式提取大腸桿菌中的代謝物,以同位素標(biāo)記的葡萄糖作為檢驗指標(biāo)比較提取效果,發(fā)現(xiàn)低溫下(-40℃)以甲醇作為提取溶劑時效果最佳。然而,衡量一個提取方法的好壞不能只關(guān)注最終代謝產(chǎn)物的量,還要確保提取過程中代謝物的穩(wěn)定,因此在提取時往往要加入緩沖溶液來減少提取過程對細(xì)胞的破壞,從而增強代謝物分析的穩(wěn)定性,如乙醇胺、磷酸鹽、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪乙磺酸(PIPES)等。除了液液萃取之外,微波輔助萃取、超臨界流體萃取等方法可縮短提取時間、提高提取效率、降低溶劑消耗,在微生物代謝物分析領(lǐng)域也被廣泛使用。2.2定量分析方法GC-MS檢測中物質(zhì)的定性需要利用其質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)檢索,故其分析過程離不開各種代謝途徑和生物化學(xué)的數(shù)據(jù)庫。基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)已有較完善的書庫供搜索、使用,而代謝組學(xué)尚未有類似功能完備的數(shù)據(jù)庫,但一些生化數(shù)據(jù)庫在代謝組學(xué)研究中,為確保分析數(shù)據(jù)的有效性與可靠性,需要進行定量分析以減少樣品處理及檢測中產(chǎn)生的差異。一般的定量分析方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法適用于檢測/修正檢測器偏差,控制分析系統(tǒng)的惰性。而內(nèi)標(biāo)法通常以同位素標(biāo)記的代謝物或非內(nèi)源性物質(zhì)(與某種代謝物特性相似的物質(zhì))作為內(nèi)標(biāo),將樣品中每種代謝物都進行定量檢測,在提取、衍生化或分析前加入內(nèi)標(biāo),可有效控制樣品處理中不同步驟產(chǎn)生的誤差。此外,以同位素標(biāo)記的微生物代謝物作為內(nèi)標(biāo)的方法目前也應(yīng)用廣泛,即微生物生長的培養(yǎng)基中,碳源物質(zhì)均用同位素標(biāo)記,則提取出的所有代謝物可作為內(nèi)標(biāo)使用。2.3分析方法及應(yīng)用基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究產(chǎn)生的大量復(fù)雜數(shù)據(jù)需要借助成熟的統(tǒng)計學(xué)工具才能夠得到合理的解釋,進而深入研究微生物代謝物的隱含意義。目前用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析的主要手段為模式識別技術(shù),包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法的算法不給出訓(xùn)練集,輸入的數(shù)據(jù)以“無人監(jiān)督”方式被分類,主要有主成分分析、非線性映射、簇類分析等;有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法會給出一些輸入數(shù)據(jù)和答案作為分類系統(tǒng)的“訓(xùn)練集”,用來構(gòu)建模型并評估必需的參數(shù),分析應(yīng)用的判別式包括偏最小二乘法-判別分析、正交算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及基于進化的計算算法。其中,主成分分析和偏最小二乘法-判別分析是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識別方法。這兩種方法通常以得分圖(Scoreplot)表示對樣品分類的信息,載荷圖(Loadingplot)表示對分類有貢獻的變量及其貢獻大小,從而發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)志物的變量。Matlab、SIMCA-P、SAS是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中的常用軟件,而近年來一些具有特殊功能的分析方法/軟件發(fā)展迅速,多維數(shù)據(jù)的表現(xiàn)形式逐漸實現(xiàn)多元化(表3)。3gc-ms聯(lián)合成像技術(shù)在代謝組中的應(yīng)用3.1發(fā)酵過程中酵母代謝的改變微生物的代謝物是基因表達的最終產(chǎn)物,基因和蛋白表達的微小變化可以在代謝物上得到放大,因此對微生物細(xì)胞提取物進行分析有助于了解細(xì)胞的能量吸收和生長過程。在基于GC-MS的微生物代謝組學(xué)研究中,首要的任務(wù)是對代謝物分離鑒定方法的建立與優(yōu)化。谷氨酸棒桿菌作為應(yīng)用廣泛的模式生物之一,其代謝組分析方面的工作已較為成熟。Strelkov以基于GC-MS首次建立了一種可快速鑒定谷氨酸棒桿菌代謝物的方法,可檢測1000多種化合物,且測量重現(xiàn)性的誤差僅在6%以內(nèi)。Borner等通過樣品預(yù)處理的平行化和部分自動化,也建立了該菌代謝組的高通量分析方法,不僅將GC-MS分析時間由60min縮短至18min,還實現(xiàn)了650種代謝物的定量化。代謝組學(xué)分析可通過代謝物差異有效鑒定微生物在不同環(huán)境下細(xì)胞的代謝差異,從而更深入地了解外界環(huán)境所造成的微觀物質(zhì)變化。Miura利用GC-MS比較白腐真菌黃孢原毛平革菌在空氣和100%氧氣條件下發(fā)酵的生長差異,獲取對氧氣壓力敏感的代謝產(chǎn)物,為其工業(yè)化進程及生產(chǎn)模式提供全新的視角。元英進課題組利用GC-TOFMS對不同條件下釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中的代謝物作了一系列的研究。首先鑒定了釀酒酵母在工業(yè)連續(xù)發(fā)酵與批次發(fā)酵時中心碳代謝流物質(zhì)、氨基酸等胞內(nèi)代謝產(chǎn)物,并采用主成分分析獲得兩種模式的標(biāo)志性物質(zhì),這有效反映了工業(yè)發(fā)酵的真實過程。隨后考察了釀酒酵母對真空發(fā)酵的適應(yīng)進化過程及接種密度對高密度發(fā)酵的影響,通過對碳代謝物質(zhì)、氨基酸及脂肪酸的鑒定,結(jié)合多維數(shù)據(jù)分析方法——PCA、HCA,得到特征性物質(zhì)的變化趨勢,驗證出在接種量為40g/L條件下酵母細(xì)胞中的甘油與脯氨酸能在高細(xì)胞濃度的壓力下有效維護酵母細(xì)胞正常的生理代謝活動,將這些代謝組信息與轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組相結(jié)合,可對酵母發(fā)酵過程形成系統(tǒng)性的認(rèn)識。在考察不同菌種對環(huán)境壓力的應(yīng)激反應(yīng)時,發(fā)現(xiàn)原始酵母在抑制劑作用下會強化蛋白分解,導(dǎo)致氧化應(yīng)激、產(chǎn)生大量活性氧自由基,而耐抑制型酵母中高含量的嘧啶可對細(xì)胞起保護作用;酵母的單倍體與雙倍體細(xì)胞,在乙醇壓力下的代謝差異明顯減弱,且單倍體的代謝更易受乙醇壓力的影響,而這種目標(biāo)代謝物檢測可作為篩選高產(chǎn)量菌株的有效途徑。此外,基因改造對某些微生物表型特征的影響并不明顯,而代謝組學(xué)能有效地探測基因改造引起的改變,并實現(xiàn)突變株間的表現(xiàn)型分化。Tian等在篩選高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌菌株時,敲除基因sdhAB或ackA-pta后,琥珀酸產(chǎn)量的提高并不明顯,但利用GC-FID、GC-MS對突變株及野生型菌株進行代謝輪廓分析后,發(fā)現(xiàn)兩種突變株中琥珀酸、天冬氨酸、脯氨酸的代謝卻存在顯著的差異。Buchinger等也利用GC-MS技術(shù)分析敲除氮源調(diào)節(jié)因子——AmtR基因?qū)劝彼岚魲U菌代謝組和轉(zhuǎn)錄組的影響,發(fā)現(xiàn)突變株中含有糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑及檸檬酸循環(huán)中代謝物的不同形式,其中谷氨酸鹽在突變株中明顯減少且排泄受損。GC-MS對多種化合物具有較強、較靈敏的分析能力,故對于鑒定比較微生物不同菌株之間的代謝物差異、同一菌株在不同生長環(huán)境下的代謝變化具有特殊的意義。結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法,將分析中存在極大差異的代謝物,作為此微生物的生物標(biāo)記物,為其更深入的研究提供必要的基礎(chǔ)。3.2gc-ms分析GC-MS聯(lián)用技術(shù)也是目前在植物代謝分析中應(yīng)用最廣泛的分離檢測手段之一。早期對土豆提取物的代謝輪廓分析已證實GC-MS平臺是分離鑒定復(fù)雜的植物基體中大量代謝物的有效工具,并能實現(xiàn)特定物質(zhì)的定量分析。Schwarzinger等利用熱分解-GC-MS分析五味子不同部位(種子、果實、種殼、樹葉等)的特性,通過熱裂解蒸發(fā)出熱穩(wěn)定的木酚素類物質(zhì)等,鑒定出的各部位組分均與CO2超臨界流體提取的分析結(jié)果相吻合。Noctor等采用GC-TOFMS建立了樹葉粗提取物中氨基酸產(chǎn)生信息的數(shù)量本質(zhì),考察擬南芥葉子的甲醇/水提取物分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差,并結(jié)合高效液相色譜(HPLC)更精確地檢測氨基酸。在利用GC-MS分析過程中,通常需要不同的提取方法獲得更完整的代謝物信息,以便較全面地了解植物中的代謝輪廓相關(guān)信息。Jin等在對紅景天揮發(fā)性組分的初步研究中,分別通過水蒸餾和頂空液相的方法提取并檢測出75和68種代謝物,在比較兩相中的組分及含量后發(fā)現(xiàn)紅景天中主要含有的芳香油類物質(zhì)均為單萜醇。Nappo等在采用GC-MS考察底棲硅藻Cocconeisscutellum的代謝輪廓時,分別在電子轟擊電離源與化學(xué)電離源下,檢測了不同有機溶劑——乙醚和丁醇提取出的代謝物,初步闡明了Cocconeisscutellum的代謝型及其在海洋底棲生物中的生態(tài)作用。通過GC-MS技術(shù)對植物不同組成的提取物進行檢測,可有效地分析出其代謝輪廓的差異,可應(yīng)用于植物的種植、品種的質(zhì)量評估等方面。Tianniam等利用熱分解-GC-MS檢測手段和PLS-DA數(shù)據(jù)分析,有效鑒別多種白芷并建立了可用于精確、可靠預(yù)測白芷質(zhì)量的模型。3.3血漿代謝動力學(xué)利用GC-MS技術(shù)對人或動物體內(nèi)的代謝物進行較全面的測定,可用于疾病的診斷、疾病發(fā)病過程的監(jiān)測、以及藥理學(xué)中對藥品療效和代謝狀況的考察。在疾病診斷中,通過對患者與正常人的血清、血漿或尿液等進行檢測比較,分析代謝物間的差異從而獲得鑒定某種疾病的標(biāo)記物。Wang和Mao通過GC-MS分別檢測了阿爾茨海默爾癥患者和腎移植手術(shù)中出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)病人的血清,由代謝輪廓分析得出二十二碳六烯酸(DHA)為阿爾茨海默爾癥中最具潛力的脂肪酸生物標(biāo)記物,而通過監(jiān)督聚簇分析代謝物水平的差異,有效地鑒定了腎移植手術(shù)中的病人狀況。血漿中代謝物的分析可對2型糖尿病患者及治療前后的代謝輪廓有清楚的認(rèn)識,還可對冠狀動脈心臟病進行臨床實踐分類識別。Wu等在對肝細(xì)胞癌的研究中,通過分析尿液和食道癌患者的粘膜組織,獲得了病人與正常人的代謝差異及臨床病理學(xué)的特性,為建立診斷模式提供了基礎(chǔ)。Lin等利用GC-MS考察了細(xì)胞系A(chǔ)549和AGS感染甲型流感病毒后的代謝輪廓,由兩者代謝物的差異及模式識別不同細(xì)胞系對病毒的敏感度。Song等抽樣調(diào)查了中國神經(jīng)管缺失的原因及先天性代謝紊亂,發(fā)現(xiàn)孕婦患者由于維生素B12缺失等會引起新生兒肝內(nèi)膽汁淤積,并誘發(fā)神經(jīng)管缺失癥。在藥理學(xué)中,GC-MS對藥品成分較強的分析鑒別能力使其廣泛應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析和藥物代謝動力學(xué)等方面的研究中。Song等利用GC×GC-TOFMS分析了78種藥品標(biāo)準(zhǔn)混合物樣品,發(fā)現(xiàn)能夠檢測出多數(shù)藥物組分,其中曲馬朵、地西泮、奧氮平和地昔帕明在分析中表現(xiàn)出典型的線性關(guān)系和精確度,除撲熱息痛和苯妥英形成不規(guī)則的峰外,其他藥物形成色譜峰均可識別分析,有效地證明GC-MS可用于觀察藥物在人體內(nèi)的吸收效果。Bando等發(fā)現(xiàn)樣品采集過程會對藥理學(xué)分析結(jié)果產(chǎn)生重要的影響,且在尿液與血漿代謝組學(xué)分析中,發(fā)現(xiàn)儲存時間會明顯改變尿液的代謝輪廓;而血漿代謝輪廓的分析受采樣點、抗凝血劑影響較大,與麻醉效果無關(guān)。Aa等利用了GC-TOF-MS對注入不同劑量雷公藤內(nèi)酯的老鼠進行血清代謝組分析,發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯會引起代謝型的偏差,并促使?；撬?、脂肪酸產(chǎn)生干擾,最終表現(xiàn)出其對肝臟的毒性。3.4gc-ms檢測GC-MS在動物、食品生產(chǎn)等領(lǐng)域也有較為成熟的應(yīng)用,通過對代謝物的檢測分析,有效地了解代謝物的變化趨勢,為宏觀的表型提供微觀的解釋。針對紅尾肉蠅因光周期誘導(dǎo)的蛹期滯育和溫度誘導(dǎo)的快速冷硬化現(xiàn)象,Michaud等利用GC-MS分析比較出該過程中代謝物變化存在極大的差異,并討論了發(fā)生改變的代謝物在生物體抗寒中發(fā)揮的作用,提出GC-MS檢測結(jié)果對昆蟲生理學(xué)系統(tǒng)分析的價值。Ralston-Hooper也利用GC×GC-TOFMS分析不同生長環(huán)境及化學(xué)應(yīng)激(阿特拉嗪)下的粘杜父魚的代謝輪廓,建立了可行的色譜峰歸一化方法,觀察不同環(huán)境條件下樣品的差異。Park等采用GC-MS分析出了豆豉發(fā)酵過程中的定向代謝物,包括20種氨基酸、12種有機酸和9種脂肪酸,并比較了發(fā)酵不同時期各物質(zhì)的變化,為豆豉生產(chǎn)過程控制提供了獨特的視角。4衍生化過程及展望GC-MS最主要