基于uplc-ms技術(shù)比較赤芍和白芍抗炎作用機制

基于uplc-ms技術(shù)比較赤芍和白芍抗炎作用機制

在代謝組中，主要使用生物質(zhì)量分析、多囊質(zhì)量分析、生物信息和計算機科學等方法對生物溶液中內(nèi)源性代謝物的變化進行研究，并正在廣泛應用于中醫(yī)學的研究中。自古以來,芍藥在醫(yī)家的眼里一直是具有多種功效的傳統(tǒng)中藥,有赤、白之分。赤芍和白芍基源相近,主成分相同,經(jīng)歷代醫(yī)家不斷豐富赤、白芍各自的功用,逐漸重視兩者的區(qū)別?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明,赤芍和白芍具有抗炎、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等作用,兩者之間既有區(qū)別又有聯(lián)系,具有鮮明的中醫(yī)藥特色。在前期對赤芍與白芍進行藥理作用比較研究的基礎(chǔ)上,本實驗采用UPLC-MS方法分析角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型和赤芍、白芍給藥后大鼠血清的代謝物指紋譜,使用多元模式識別方法分析給藥組與正常組大鼠血清的代謝物差異,尋找與赤芍和白芍抗炎作用密切相關(guān)的潛在生物標記物,為深入探討其作用機制奠定基礎(chǔ)。1材料表面1.1實驗動物SD雄性大鼠,180~220g,由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號SCXK(滬)2003-0002。1.2毛科植物獸藥paeonieveitchiilus和p.lactiflusa帶點赤芍藥材購自四川(重慶,批號cs20100101),白芍藥材購自上海藥業(yè)有限公司(安徽,批號bs20100301),經(jīng)上海中醫(yī)藥大學吳立宏副研究員鑒定分別為毛茛科植物芍藥PaeoniaeveitchiiLynch和P.LactifloraPall.的干燥根,標本保存在上海中藥標準化研究中心。取赤芍和白芍藥材各1.0kg,分別加8倍量80%乙醇溶液回流提取3次,每次2h,合并提取液,減壓回收,得浸膏,冷凍干燥,得粉末。1.3儀器、試藥和儀器WatersAcquityUPLCSystem,ZQ2000quadtruplespectrometry(Waters公司,USA);YLS-7A足趾容積測量儀(山東省醫(yī)學科學院設備站);HettichUNIVERSAL32臺式冷凍離心機(GermanyHettichCorporation);低溫高速離心機(三洋公司,日本)。角叉菜膠(SIGMA,批號90K1535);阿司匹林(SIGMA,批號048K0015)。甲醇、乙腈(色譜純,Tedia公司,USA);水為MilliQ超純水(Millipore,Bedford,USA);乙酸銨、冰乙酸(色譜純,Fisher公司,Nepean,Ont.,Canada)。2方法2.1致炎及血清觀察雄性SD大鼠40只,按體重隨機分為4組,即模型組、陽性對照組、赤芍和白芍給藥組。各給藥組大鼠適應性飼養(yǎng)3d后灌胃給予實驗供試液,給藥劑量折合成生藥量為15g·kg-1;陽性對照組灌胃給予阿司匹林50mg·kg-1,給藥容積0.01mL·g-1,供試液均用雙蒸水配制,模型組灌服同容積生理鹽水,連續(xù)給藥6d。第6d給藥1h后,分別在每鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜膠混懸液0.1mL,分別于致炎前及致炎后30min,1,2,3h分別測定足趾體積并計算腫脹度。各組大鼠致炎3h后分別于腹主動脈收集血液,至室溫下靜置2h析出血清,4000r·min-1離心10min,取上層淡黃色透明血清-80℃保存。取100μL解凍后血清加入400μL乙腈-甲醇(3∶1)混合溶液沉淀蛋白,4℃下12000r·min-1離心15min,移取上清液供UPLC-MS分析。2.2柱溫b計算色譜條件:WatersHSST3色譜柱(2.1mm×100mm,1.7μm);流動相5mmol·L-1乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸,A)-乙腈(B),梯度洗脫,0~1min,98%A;1~3min,98%~50%A;3~12min,50%~40%A;12~16min,40%~10%A;16~20min,10%~98%A。流速0.3mL·min-1;柱溫45℃;進樣量5μL。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;鞘氣(N2)流速30L·min-1;輔助氣(N2)流速10L·min-1;毛細管電壓38.00V,毛細管溫度300℃,毛細管源內(nèi)電壓5.00kV,掃描范圍m/z100~1000.00。總離子流圖見圖1。2.3兩組患者差異比較藥理實驗數(shù)據(jù)以x珋±s表示,采用統(tǒng)計學軟件SPSS12.0的獨立樣本t檢驗進行組間差異比較。LC-MS數(shù)據(jù)通過m/z識別、MassLynx軟件匹配、歸一化等計算過程得到矩陣,導入SMCA-P12.0(Umetrics,Umea,瑞典)軟件中進行主成分分析(PCA)與偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。3結(jié)果3.1角叉菜膠致足外水腫的抑制作用實驗結(jié)果表明大鼠連續(xù)給藥6d后,赤芍和白芍提取物在0.5~1h對大鼠角叉菜膠致足趾腫脹均有較好的抑制作用,與模型組相比有顯著性差異,但組間無明顯差別;在2~3h僅赤芍提取物對大鼠角叉菜膠致足趾腫脹有較好的抑制作用,與對照組相比有顯著性差異,見表1。3.2hmdb網(wǎng)站初鑒定將LC-MS結(jié)果進行PCA和PLS-DA分析。模型組與赤芍和白芍給藥組樣本點完全分離,且各組內(nèi)樣本點聚集較好,說明大鼠口服給予赤芍和白芍提取物后機體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生明顯改變,并根據(jù)其變化可以將各組樣品進行區(qū)分,結(jié)果見圖2。給予白芍提取物3h后代謝物組輪廓更趨近模型組成分區(qū)間,與藥理實驗結(jié)果一致。使用變量重要性投影(VIP)評價潛在的生物標識物,利用PLS-DA計算VIP值,取大鼠血清代謝物譜中VIP值大于1的變量為生物標示物,共發(fā)現(xiàn)691個。通過HMDB網(wǎng)站檢索,初步鑒定部分可能的生物標識物見表2。炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對組織損傷或致病因子侵入所發(fā)生的防御反應,其典型特征為局部紅、腫、熱、痛、功能障礙,炎癥局部組織可發(fā)生變質(zhì)、滲出、增生。多不飽和脂肪酸花生四烯酸可通過環(huán)氧化酶途徑和脂氧化酶途徑分別代謝為前列腺素(prostaglandins,PGs)、血栓素(thromboxane,TXs)、白三烯(leukotrienes,LTs)等代謝物,在炎癥和免疫反應中起重要調(diào)節(jié)作用。炎癥發(fā)生時,PGEs能增加微靜脈、毛細血管后微靜脈的通透性,并通過間接刺激組胺和緩激肽釋放,后者增加血管通透性的作用比PGEs要強。但是炎癥的發(fā)展不是因為PGs總量的變化,而是不同類型PGs間的平衡失調(diào)所致。同時PGs還具有趨化白細胞、抑制溶酶體酶的釋放、致敏和致痛,以及與其它炎癥介質(zhì)如自由基、白介素-1等的密切相關(guān)。由因子載荷圖及結(jié)合原始圖譜數(shù)據(jù)分析,赤芍、白芍給藥組中白細胞三烯A4和前列腺素E2的相對含量下降,但與模型組無顯著性差異。赤芍和白芍能顯著提高炎癥大鼠血清中前列腺素E3的水平和降低前列腺素F2α的水平,與模型組相比均有顯著性差異,見圖3;而前列腺素E3有抑制前列腺素E2合成的作用,說明赤芍和白芍的抗炎作用可能與影響機體內(nèi)前列腺素F2α和前列腺素E3的水平有關(guān)。在實驗中前列腺素F2α和前列腺素E3的不同組別間的相對濃度變化符合一般炎癥的規(guī)律,赤芍和白芍給藥間組前列腺素F2α和前列腺素E3的水平也有顯著性差異,提示其抗炎作用靶點可能不同,有待于進一步研究。4赤充物對大鼠血清代謝的影響本研究建立角叉菜膠致大鼠足趾腫脹動物模型,觀察赤芍和白芍的抗炎作用,結(jié)果表明赤芍和白芍均有較好的抗炎效果,但是作用時間與強度有差別。同時建立了超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜分析大鼠血清樣品代謝物指紋圖譜的方法,并進行了赤芍和白芍對角叉菜膠致足趾腫