雙縮脲法測蛋白質(zhì)濃度

一、 目的：1?了解雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的基本原理。2?熟悉雙縮脲法測蛋白質(zhì)濃度的實驗操作方法。二、 原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180°C左右加熱，放出1個分子氨后得到的產(chǎn)物在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。三、 實驗試劑和儀器硫酸銅、酒石酸鉀鈉、NaOH、KI、酪蛋白雙縮脲試劑：取0.75g硫酸銅和3.0g酒石酸鉀鈉溶于250ml蒸餾水，加入150ml10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自動還原成一價氧化亞銅沉淀），用水稀釋至500ml。此試劑可以長期保存。10mg/ml標準蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸餾水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。待測樣品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。儀器：容量瓶，試管，移液管，量筒，燒杯，膠頭滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度計四、 步驟標準曲線的繪制（表1）。加入物加入量（ml）012345標準液0.00.20.40.60.81.00.05mol/lNaOH1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0室溫下振蕩均勻，顯色30min后，用分光光度計于540nm測定各管吸光度。以光密度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標繪制標準曲線。樣液配制（表2）。加人物0.05mol/l的NaOH空白牛血清蛋白原液稀釋5倍牛血清蛋白稀釋10倍牛血清蛋白稀釋20倍牛血清蛋白稀釋30倍牛血清蛋白20mg/ml酪蛋白溶液稀釋4倍20mg/ml酪蛋白樣液0.01.01.01.01.01.01.01.0

(ml)0.05mol/l的NaOH1.00.00.00.00.00.00.00.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.04.04.0室溫下振蕩均勻，顯色30min后，用分光光度計于540nm測定各管吸光度。根據(jù)標準曲線計算個樣品濃度。五、結(jié)果標準曲線1012345蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）02.04.06.08.010.0光密度0.0000.0880.1690.2600.3500.426分析結(jié)果牛血清蛋白原液稀釋5倍牛血清蛋白稀釋10倍牛血清蛋白稀釋20倍牛血清蛋白稀釋30倍牛血清蛋白20mg/ml酪蛋白溶液稀釋4倍20mg/ml酪蛋白光密度0.7730.5410.2350.1270.0850.6370.200樣液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）17.9612.575.452.941.9614.804.63蛋白質(zhì)原濃度（mg/ml）17.9662.8254.4858.7458.8114.8018.54六、討論為提高準確度將之前標準曲線繪制的蒸餾水換成0.05mol/lNaOH溶液。樣液+蒸餾水+雙縮脲試劑的總體積為5ml,體積不一樣，蛋白質(zhì)濃度計算不方便。標準曲線選擇不能只看R2,還應該看曲線斜率和截距。R2大小與實驗操作和儀器都有關(guān)系。配蛋白質(zhì)溶液應用的是0.05mol/L的NaOH配制，用0.05%NaOH可能會影響干酪素的溶解效果。（但實驗結(jié)果分析顯示，低濃度的NaOH對實驗結(jié)果影