木豆葉中黃酮微波提取工藝的優(yōu)化

木豆葉中黃酮微波提取工藝的優(yōu)化

木豆科植物（l.）milsp是一種廣泛分布于亞熱帶和亞熱帶地區(qū)的木豆科植物。木豆是一種多用途木本豆類作物,可食用。此外,木豆在國內(nèi)外民間藥中廣泛用于鎮(zhèn)痛、肝炎、結(jié)石、黃疸、小兒水痘和糖尿病等癥。藥理學調(diào)查顯示木豆中有效活性成分主要是黃酮類和芪類化合物等。木豆葉中含有多種黃酮,包括木犀草素、芹菜素、球松素、葒草苷、牡荊苷等。其中,木犀草素及其八位碳苷(葒草苷)是植物體中重要的黃酮,具有抗炎、抗氧化、多靶點抗菌、舒張血管平滑肌、降低血漿黏度、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫力等顯著藥理作用。微波輔助提取技術(shù)作為新發(fā)展的一種提取方法具有提取時間短、溶劑消耗少、效率高、無環(huán)境污染等優(yōu)勢。本實驗將微波輔助提取與傳統(tǒng)熱回流、超聲波及浸泡提取方法相比較,并采用中心組合設(shè)計對影響微波輔助提取工藝的參數(shù)進行了優(yōu)化,旨在為從木豆葉中提取黃酮提供經(jīng)濟、高效、綠色的途徑。1超聲清洗法illsp木豆葉2009年9月采摘于海南省,當年生,陰干,經(jīng)東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室聶紹荃教授鑒定為豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥葉。將葉粉碎,過篩分為20、30、40、50、60目。保存于-20℃冰箱中,備用。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)及葒草苷、木犀草素和蘆丁對照品(質(zhì)量分數(shù)均大于98%)購于Sigma公司;甲醇為色譜純,雙蒸水自制;其他試劑均為分析純。KQ—250DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);MAS—II微波反應(yīng)罐(新儀微波化學科技有限公司);安捷倫1200系列高效液相色譜儀包括:G1322A脫氣機、G1311A泵、G1365B多波長檢測器。2方法和結(jié)果2.1對照品溶液的制備參照畢和平等測定總黃酮的方法。取1mL提取液于10mL量瓶中,加入5%NaNO20.3mL,混勻,靜置6min;加入10%AlCl3·6H2O0.3mL,混勻,靜置6min;加入1mol/LNaOH4mL,混勻,靜置15min;75%乙醇加至刻度線,混勻,于510nm處測定吸光度(A)值。精密稱取蘆丁對照品10.03mg,置于10mL量瓶中,用75%乙醇定容,再取5個10mL量瓶,分別配制成50.15、100.30、200.60、300.90、601.80μg/mL蘆丁對照品溶液。按上述方法制作標準曲線,其回歸方程為A=1.271C-0.0135,r2=0.9996,表明蘆丁在50.15~601.80μg/mL線性關(guān)系良好。2.22草素和木犀草素的hplc試驗參考Liu等的HPLC法測定木豆幼苗中葒草苷和木犀草素的方法。2.2.1流動相-0.1%苯甲酸甲醇溶液法色譜柱為HIQsilC18W柱(150mm×4.6mm,5μm);柱溫30℃;體積流量1mL/min;進樣體積10μL;流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸甲醇溶液(B),梯度洗脫:0~15min,33%~33%B;15~40min,33%~75%B;40~45min,75%~33%B。檢測波長254nm(木犀草素)、330nm(葒草苷)。2.2.2標準曲線及線性回歸法分別精確稱量木犀草素及葒草苷對照品3.40、2.70mg于10mL量瓶中,加入色譜純甲醇溶解、混勻,配制成含木犀草素0.340mg/mL、葒草苷0.270mg/mL混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液0.25、1.00、1.50、2.50、5.00mL置于5.0mL量瓶中,加甲醇定容,濾過,分別進樣10μL,記錄峰面積。以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸,得回歸方程分別為木犀草素Y=41363.64X+26.33,r2=0.9991;葒草苷Y=11469.4X-39.6,r2=0.9990;表明木犀草素在17.00~340.00μg/mL、葒草苷在13.50~270.00μg/mL線性關(guān)系良好。2.3提取液用量的確定參照Wu等的方法,對DPPH自由基清除能力進行比較。取4種提取方法所得質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.125mg/mL提取液100μL,分別加入75%乙醇1.4mL,混勻;再加入0.004%DPPH乙醇溶液1mL,混勻,室溫避光靜置70min,于510nm測定A值。2.4數(shù)據(jù)分析采用中心組合試驗設(shè)計,實驗均重復3次,數(shù)據(jù)分析處理使用Stastitica6.0軟件。2.5不同方法的樣品、制備和結(jié)果的比較2.5.1木豆葉提取物提取分別取20、30、40、50、60目的木豆葉粉末5.00g混勻,備用。參照文獻以不同方法提取。(1)熱回流提取取上述木豆葉粉末(5.00g)加入75%乙醇75mL,于80℃條件下熱回流提取,分別提取30、60、90、120min各3次,提取液濾過、合并,定容,測定。(2)超聲提取取上述木豆葉粉末(5.00g)加入75%乙醇75mL,于45℃、功率250W條件下超聲提取3次,提取時間分別為30、45、60、90min,提取液濾過、合并,定容,測定。(3)浸泡提取取上述木豆葉粉末(5.00g)加入75%乙醇75mL,于室溫浸泡6、12、24、36h各3次,提取液濾過、合并,定容,測定。(4)微波提取取上述木豆葉粉末(5.00g)加入75%乙醇75mL,于55℃、功率500W條件下微波提取5、10、15、20min各3次,提取液濾過、合并,定容,測定。2.5.2微波輔助提取與微波熱回流萃取對比熱回流、超聲、浸泡和微波提取提取總黃酮、葒草苷及木犀草素的最佳結(jié)果見表1,總黃酮最高提取率分別為36.08、31.58、29.58、33.29mg/g,最佳提取時間分別是60、90min、12h、10min,其中熱回流的效果最佳。而與總黃酮不同,葒草苷和木犀草素提取率最高是微波10min,分別為3.85、0.09mg/g。對不同方法最高提取率的差異顯著性分析(表1)可知,熱回流雖然對總黃酮提取率最高,但與微波相比差異不顯著,而微波提取葒草苷和木犀草素與其他方法比較差異顯著(P<0.05)。由此可知,微波輔助提取在從木豆葉中提取黃酮具有明顯的優(yōu)勢,其主要原因是微波具有由內(nèi)而外同時加熱的特點。微波提取時高頻電磁波能穿透萃取介質(zhì)到達材料內(nèi)部的維管束和細胞系統(tǒng)引起溶劑加熱,使細胞內(nèi)部的溫度升高、壓力超過細胞空間膨脹的能力,從而導致細胞破裂,其內(nèi)的有效成分自由流出被周圍的溶劑溶解,達到提取的目的。常規(guī)方法如熱回流,浸泡的提取機制是溶質(zhì)分子熱運動和溶質(zhì)在不同濃度溶液之間的擴散,細胞壁破裂困難,有效成分釋放慢,故提取率低。超聲波提取雖有產(chǎn)生空化破壁的作用,但破壁效果不及微波,提取率遠遠小于微波,且消耗的時間長。2.5.3微波輔助提取不同方法提取物對DPPH自由基的清除效果見圖1。微波提取物清除DPPH自由基效果最佳,0.125~4.00mg/mL提取物清除率由(39.68±3.88)%增加至(95.18±2.00)%。其IC50值為0.26mg/mL,明顯低于超聲、浸泡和熱回流提取(0.45、0.41、0.39mg/mL),結(jié)果說明微波輔助提取物能夠具有較強的抗氧化活性。綜合比較提取物中化合物的得率,消耗的溶劑和時間及清除DPPH自由基效果,微波輔助提取都具有明顯的優(yōu)勢,適合提取木豆葉中的黃酮葒草苷和木犀草素。因此,基于提取時間的比較,以下的試驗選擇10min用于的微波提取。通過預試驗知微波的功率(決定加熱速率)對提取率影響不顯著,因為實驗使用MAS—Ⅱ微波反應(yīng)罐(新儀微波化學科技有限公司)是采用間歇加熱方式,加熱到達提取溫度后停止加熱,待降溫后再補足,因此試驗選用微波功率固定值500W。2.6優(yōu)化和結(jié)果以及微波工藝中參數(shù)的結(jié)果2.6.1工藝參數(shù)水平采用25的中心組合設(shè)計優(yōu)化微波提取木豆葉中葒草苷和木犀草素工藝參數(shù),包括:X1材料粒徑(目)、X2乙醇體積分數(shù)(%)、X3溫度(℃)、X4料液比和X5提取次數(shù)(次),因素水平見表2。2.6.2模型擬合程度的確定不同實驗設(shè)計條件下,木犀草素與葒草苷提取率的預測值與實驗值見表3。利用實驗數(shù)據(jù)進行多元擬合分析建立二次方程模型。對方程進行方差分析,表明兩個回歸模型在極顯著水平(P<0.001);r2分別為0.969和0.976,說明模型擬合程度良好,實驗誤差小。對擬合的二次多項式各項的F估計值分析可知X32即溫度平方項對葒草苷提取率影響最顯著;乙醇體積分數(shù)平方項X22對木犀草素影響最顯著。而X1、X2、X3、X1X3、X1X4、X2X5、X3X4、X3X5、X4X5項對葒草苷提取率方程各項的F值小于P=0.05的對應(yīng)值,X1、X1X2、X1X3、X1X4、X1X5、X3X5、X4X5對木犀草素提取率的各項的F值小于P=0.05的對應(yīng)值,即對提取率影響不顯著,在不影響方程模型的基礎(chǔ)上忽略對回歸方程影響不顯著的項,對葒草苷和木犀草素提取率的二次多項式簡化如下:2.6.3微波高溫輻射溫度和溫度對提取率的影響葒草苷是木犀草素糖苷,葒草苷分子結(jié)構(gòu)是在木犀草素8位C上連一個葡萄糖。如圖2、3所示,對影響葒草苷和木犀草素提取率的各因素響應(yīng)面分析可知不同因素對兩個化合物的影響及因素之間相互作用趨勢基本相同。例如,溶劑是提取過程的基礎(chǔ),如圖2、3所示,葒草苷和木犀草素的提取率都隨著乙醇質(zhì)量分數(shù)升高先增加后減少,但木犀草素是苷元,極性小,提取最適乙醇質(zhì)量分數(shù)比葒草苷大,因此需要通過優(yōu)化乙醇質(zhì)量分數(shù)提高目標化合物總體提取率。而葒草苷和木犀草素提取率(圖2、3)隨著溫度升高,先快速增加,后不變或稍有減少。這一結(jié)果說明葒草苷和木犀草素在微波高溫輻射時分解。增加溫度,可加快化合物從植物材料的游離和增加目標化合物的溶解度,但當溫度過高時會引起熱敏性化合物分解。因此,適當?shù)臏囟瓤梢允鼓繕嘶衔铽@得最大的提取率。2.6.4草苷和木駁岸的提取率為5.由中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析得到的最佳工藝條件為:木豆葉粒徑46.97目,乙醇體積分數(shù)80.39%,提取溫度59.60℃,料液比1∶20.41,提取4.40次,葒草苷和木犀草素的提取率為4.43mg/g和0.10mg/g。3中心組合設(shè)計優(yōu)化工藝條件及響應(yīng)面分析本實驗比較了微波輔助提取技術(shù)與傳統(tǒng)熱回流、超聲波及浸泡的方法提取木豆葉中葒草苷、木犀草素和總黃酮提取率及提取物的抗氧化活性,實驗表明微波輔助提取能利用短的時間獲取更高的提取率且提取物具