微波提取-壓力氣氛滅菌法測定水中稀堿水的研究

微波提取-壓力氣氛滅菌法測定水中稀堿水的研究

著名的野生茶，如甜茶、眉毛茶、白茶、龍舌茶和清溪草。屬于葡萄園科蛇葡萄屬的顯齒蛇葡萄園，屬于野生藤本植物。藤茶中含有多種化學(xué)成分,包括水分、蛋白質(zhì)、維生素、多酚和黃酮等,其中黃酮類化合物具有最重要的藥理作用。而二氫楊梅素是其中最重要的黃酮類化合物。二氫楊梅素(Dihydromyricetin,簡稱DYM)具有黃酮化合物的基本結(jié)構(gòu),且C環(huán)2位和3位碳原子上具H原子,沒有雙鍵,故在分類上屬于黃酮中的二氫黃酮類化合物。該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。二氫楊梅素具有降血糖、降血脂、保肝、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和止咳等藥理作用。所以,二氫楊梅素在食品、保健品以及醫(yī)藥方面有重大的研究前途。本文結(jié)合大量的文獻,利用微波裝置和食品高溫高壓滅菌裝置的結(jié)合,用可見分光光度法的測定,來探討藤茶二氫楊梅素新的提取工藝。進一步提高和簡化藤茶二氫楊梅素的提取,利用正交實驗優(yōu)化最佳的提取條件。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1乙醇、試劑和儀器藤茶葉:芳村茶葉市場;pH9~10的NaOH堿水:自制;95%乙醇:分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;無水AlCl3:分析純,廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司;蒸餾水:廣州大學(xué)實驗室自制;二氫楊梅素純品:廣東省果蔬深加工重點實驗室制。1.2實驗方法1.2.1稀堿水+轉(zhuǎn)子水準(zhǔn)確稱取1g經(jīng)過20目的分子篩的藤茶葉,于微波裝置反應(yīng)膠罐中,加入稀堿水,轉(zhuǎn)子。將反應(yīng)膠罐于微波裝置中進行微波提取,提取完后,將反應(yīng)膠罐中的藤茶葉及液體全部轉(zhuǎn)移到小燒杯中,封上保險紙,于高溫高壓裝置中提取,一定時間及溫度后,趁熱過濾,濾液待測。1.2.2空白液的制備將趁熱抽濾的提取液于大試管中,抽取0.1mL于10mL的容量瓶中,用95%的乙醇定容到刻度,搖勻,抽取1mL于另外的10mL容量瓶中,加入3mL的AlCl3,用95%的乙醇定容到刻度,同時做空白液。在室溫下放置40min,于分光光度計中測定。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.1紫外分光光度的測定稱取微量的二氫楊梅素純品,用95%分析純乙醇溶解并定容至刻度,搖勻。抽取1mL于10mL容量瓶中,精確加入5%AlCl3溶液3mL,95%乙醇定容至刻度,在室溫下放置40min,于紫外分光光度儀UV-2450中掃描,見圖2。從純品的掃描圖圖2可知,最大的吸收波長是205.80nm。但205.80nm和309.80nm是紫外區(qū),沒有377nm的可見光區(qū)操作方便。而且從圖3中可看到,提取液的測定掃描曲線和二氫楊梅素純品的掃描曲線十分相似,都在波長377nm附近有較穩(wěn)定的吸收。故取吸收峰377nm的2/3,即404nm作為測定吸光度的波長。圖3中由上而下(甲、乙、丙)分別是不同條件下二氫楊梅素提取液(甲、乙)及純品二氫楊梅素(丙)的測定掃描圖。2.2容量瓶測定方法精確稱取二氫楊梅素純品10.50mg,用95%分析純乙醇溶解,于10mL容量瓶中定容至刻度,搖勻。分別精確地移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL容量瓶中,按1.2.2的測定方法,于404nm處測定。結(jié)果見表1和圖4。從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到的回歸方程為:A=6.42x+0.0156,R2=0.9998(n=5)。2.3總黃酮提取率計算公式將抽濾液按照1.2.2的測定方法,測定其提取液的吸光度,其提取率的計算公式為:式中:A為提取液的吸光度;K為二氫楊梅素在總黃酮中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù),K=0.86。把K=0.86,P=1000代進公式后,簡化為:3微波條件優(yōu)化本實驗影響藤茶二氫楊梅素因素主要有溶劑的pH值、高溫高壓的時間、料液比、微波萃取溫度、微波萃取時間、微波裝置的功率、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速等因素的影響,分別進行單因素的實驗,以選擇較好的水平,用正交實驗來優(yōu)化最佳提取條件。3.1ph值對提取率的影響由于二氫楊梅素具有多個羥基官能團,等電點偏酸性,所以溶劑的pH值對提取過程有一定的影響。準(zhǔn)確稱取1g藤茶,料液比為1∶25,微波溫度為95℃,微波時間為5min,微波功率為600W,高溫高壓時間為15min,pH值對提取率的影響結(jié)果見表2和圖5。由圖5可知,稀堿水的提取率最高,宜采用堿性溶劑提取。一般堿水提取時提取率可提高1%~2%或更多,同時還易于保存;但堿性不能太強,強堿在加熱條件下會破壞黃酮化合物的母核以及損壞提取容器設(shè)備。3.2料液比的確定二氫楊梅素是一個極性化合物,水是一種很好的提取劑。不同的料液比對二氫楊梅素影響較大,因為二氫楊梅素從藤茶中提取出來,水量的多少直接影響其溶解量。料液比對提取率的影響結(jié)果見表3和圖6。隨著溶劑量的增多,二氫楊梅素的提取率也相繼增大,但從圖6中可以看到,料液比為1∶25以后,藤茶二氫楊梅素的提取率增加幅度很少,水量的增多還會造成二氫楊梅素的純化的時間增長,純化率降低。所以從圖6中選擇料液比1∶15~1∶25為正交實驗的水平范圍。3.3微波加熱加熱近年來發(fā)展起來的微波輔助提取技術(shù),具有提取時間短和提取效率高等優(yōu)點。微波加熱的原理是利用被加熱物質(zhì)的極性分子(如H2O)在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列,從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦而發(fā)熱。微波加熱是能量直接作用于被加熱物質(zhì),其模式為:熱源-樣品-器皿。微波作用可以有效地將茶葉的細(xì)胞壁及結(jié)構(gòu)破壞,使有效成分易于從細(xì)胞中釋放出來,但難于擴散到溶劑中,所以本實驗把微波加熱作為一種輔助手段,高溫高壓提取把細(xì)胞已經(jīng)被破壞了的茶葉中的二氫楊梅素較好地溶于溶劑中,從而對提高提取率有很大的幫助。3.3.1微波溫度對二氫楊樹牢干制備二氫蝦考慮到二氫楊梅素在熱水中的溶解度較高,但提取溫度不能超過100℃,否則其他黃酮類會被提取出來,影響測定結(jié)果。微波溫度對提取率的影響見表4和圖7。從圖7可知,微波溫度對二氫楊梅素的提取影響較大,是一個重要的影響因素,溫度低于70℃時,提取率非常低,提取率不超過10%。隨著溫度的提高,提取率也相對的提高,但是提取溫度不能超過100℃,因為提取溫度在100℃以上時候,其他的黃酮類化合物會被提取出來,影響測定結(jié)果,所以在本實驗中微波溫度在95℃時提取效果最佳。所以選擇溫度75~95℃為正交實驗的水平范圍。3.3.2微波保持時間對二氫楊樹莓原螯蝦提取率的影響微波時間主要是指,在一定的微波溫度下,微波加熱所保持的時間。按照1.2.1提取方法和1.2.2測定方法,微波時間對提取率的影響結(jié)果見表5和圖7。從表5和圖7可以看到,微波的保持時間對二氫楊梅素的提取有一定的影響,但影響不大。隨著微波時間的延長,其提取率也相繼增大,但增大的幅度很少。主要原因可能是微波把茶葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,黃酮類化合物被釋放而附在茶葉表面。在微波裝置中,隨著微波保持時間的延長,藤茶中黃酮類化合物并沒有溶于溶劑中,所以微波作用只是起到了破壞茶葉細(xì)胞的作用,微波保持時間延長對二氫楊梅素的提取影響較小。所以選擇微波時間1~5min為正交實驗的范圍。3.4提取溫度和工氣壓力目前高壓技術(shù)的研究多用于食品的滅菌保存方面,高壓技術(shù)還可用于微生物細(xì)胞破碎,以有效提高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的提取效率。經(jīng)高壓處理后,提取效率明顯提高。但由于高壓設(shè)備要求比較高,所以采用食品研究中的儀器———壓力蒸氣滅菌器。一定的壓力有助于被微波破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的藤茶中的黃酮類化合物溶于溶劑中,從而提高提取率。經(jīng)實驗證實,設(shè)置儀器溫度為105℃,高壓15min和45min后,提取液的溫度為78~94℃,提取液的提取溫度沒有超過100℃。105℃下其蒸氣壓力為0.5個大氣壓?？疾椴煌母邷馗邏簳r間對提取過程的影響,其實驗步驟為:設(shè)置壓力蒸氣滅菌器的溫度為105℃,分別在高溫高壓時間5、15、30、45、60min條件下,對按照1.2.1提取方法得到的提取液進行處理,按1.2.2測定方法測定,結(jié)果見表6和圖8。從表6和圖8可以看到,二氫楊梅素的提取隨著高溫高壓時間的延續(xù),其提取率相繼增加,但30min后,二氫楊梅素提取率增大幅度減少,原因可能是二氫楊梅素的提取已達到了飽和,隨著時間的延長,其他雜質(zhì)也相繼提取出來,例如:30min的提取液是黃色的,但60min的提取液是綠色的,初步認(rèn)為是色素、咖啡堿、甘寧等雜質(zhì)的溶出,使提取液的顏色變深。從圖8可以看到,經(jīng)高溫高壓提取后,其曲線與沒有經(jīng)過高溫高壓處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線在形狀上幾乎一樣,所以,高溫高壓提取沒有造成二氫楊梅素結(jié)構(gòu)的破壞。高溫高壓對整個提取過程影響較大的,從表4的第5組數(shù)據(jù)可知,沒有經(jīng)過高溫高壓提取時,其提取率為20.5%,然后經(jīng)過高溫高壓提取,其數(shù)據(jù)見表6可知,提取率增大1%~6%。3.5提取過程的工況和轉(zhuǎn)速微波功率主要的作用體現(xiàn)在溶劑的提溫速度和加熱時間上,功率越大,提溫速度越快,而且它還對茶葉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞有一定的影響。本實驗選擇功率300~600W為正交實驗的水平范圍。轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速是在提取過程中,轉(zhuǎn)子起到攪拌的快慢作用。它只在微波裝置起攪拌作用。從低速到高速為正交實驗的水平范圍。4正交實驗優(yōu)化最佳提取條件4.1壓力蒸氣滅菌器的正交分析本實驗是以藤茶二氫楊梅素的提取率為單指標(biāo)的。影響二氫楊梅素的提取率主要有兩大部分:微波裝置和壓力蒸氣滅菌器。微波裝置的因素包括:料液比、微波溫度、微波保持時間、微波功率和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速。壓力蒸氣滅菌器的主要因素是高溫高壓處理時間。則本實驗采用6因素3水平的正交方式來進行正交實驗。從以上討論的單因素對二氫楊梅素提取率的影響來確定每個因素的水平。選擇的料液比水平為:1∶15、1∶20、1∶25;微波溫度水平75、85、95℃;微波保持時間1、3、5min;微波功率300、500、600W;轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速:低速、中速、高速;高溫高壓提取時間(105℃)15、30、45min。4.2微波最佳提取條件的確定選用正交表L18(3)7,其6因素3水平的相互作用的結(jié)果見表8和圖9。從正交實驗表的數(shù)據(jù)(表9)可知,影響二氫楊梅素的提取率的因素順序為1>2>3>5>6>4,即高溫高壓時間影響最大,接著是料液比>微波時間>轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速>微波保持時間。從效應(yīng)曲線圖7可知,最佳的提取條件為高溫高壓時間45min、料液比1∶25、微波溫度95℃、微波時間5min、微波功率500W、轉(zhuǎn)子高速。重做實驗18和正交最佳的提取條件,其結(jié)果見表9。從表9的實驗結(jié)果可知,正交最佳的提取條件的提取率為30.94%最高,所以本實驗的最佳條件為高溫高壓時間45min、料液比1∶25、微波溫度95℃、微波時間5min、微波功率500W、轉(zhuǎn)子高速。5最佳提取條件的確定本實驗由二氫楊梅素的提取到測定過程,連貫性較強,需要連續(xù)完成。因為二氫楊梅素在冷水中溶解度很小,熱的二氫楊梅素濾液在室溫中放置一段時間后,因溶劑的降溫,二氫楊梅素會從溶劑中析出,影響測定的操作和結(jié)果。藤茶中二氫楊梅素的提取,溫度是關(guān)鍵。提取的溫度但不能超過100℃,否則其他黃酮類化合物被提取出來,影響測定結(jié)果。而且,提取液應(yīng)高溫抽濾,避免二氫楊梅素從溶劑中析出。本實驗的測定方法是吸光度法。Al3+與二氫楊梅素絡(luò)合顯亮黃色。但是放置時間對測定結(jié)果影響較大,放置時間以40min為宜。經(jīng)過單因素和正交實驗,確定了最佳提取條件為高溫高壓時間45min,料液比1∶25,微波溫度95℃,微波時間5min,微波功率500W,轉(zhuǎn)子高速