柴疏四君湯對肝郁脾虛三證模型大鼠消化功能改變的影響

柴疏四君湯對肝郁脾虛三證模型大鼠消化功能改變的影響

“方證相關性”不僅是中醫(yī)辨證論治原則的核心，也是方劑科學的邏輯基礎。中醫(yī)經(jīng)驗表明,由特定藥味組成、體現(xiàn)一定治法的方劑有其特定的適應病證,即方與證之間的關聯(lián)程度越大,其作用后的療效越好。本研究以疏肝健脾方和肝郁、脾虛及肝郁脾虛證之間存在不同程度的關聯(lián)為立論前提,從“同方異證”的角度,運用實驗研究的方法,比較觀察了具有疏肝健脾功用的柴疏四君湯對肝郁、脾虛及肝郁脾虛不同證候模型大鼠的消化系統(tǒng)功能的影響,以探討該方與三證之間的關聯(lián)性。實驗動物、試劑與儀器1.試驗藥物中藥材人參、白術、茯苓、柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草共10味,由北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司提供,經(jīng)鑒定均為正品。柴疏四君湯為柴胡疏肝散和四君子湯的合方:柴胡4g,陳皮4g,川芎3g,香附3g,枳殼3g,芍藥3g,人參4g,白術3g,茯苓3g,炙甘草2g。采用常規(guī)水煎提取的方法,制成顆粒。使用前以蒸餾水配制成濃度為12.87%(相當于藥材)的口服液。2.動物健康Wistar大鼠,均為雄性,體質量(240±10)g,級別SPF/VAF,動物許可證號為SCXK(京)2011-0004,由北京斯貝福實驗動物中心提供。所有動物提前1周購入,動物房常規(guī)飼養(yǎng)。3.試劑胃泌素(GAS)、胃動素(MTL)、生長抑素(SS)(批號:20121130)、膽囊收縮素(CCK)(批號:20130415)放射免疫分析試劑盒,由北京華英生物技術研究所提供。D-木糖對照品(批號:20121226):天津市光復精細化工研究所。胃蛋白酶測定試劑盒(批號:20121202):南京建成生物工程研究所。4.儀器低溫離心機(DDL25型):上海安亭科學儀器廠。TD25-WS48孔多管架自動平衡離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司。自制大鼠束縛器:為有機玻璃制成的圓筒狀結構,主筒長25cm,筒口外經(jīng)7cm,內(nèi)徑5cm,前端置有一直徑小于主筒、可前后調節(jié)的帶有透氣孔、便于大鼠頭伸進的有機玻璃前罩,后端為前后間距可調的開關閘門。塑料鋼化桶,高60cm,桶口徑50cm,執(zhí)行標準:Q/WHC02-2002,溫嶺大溪宏程塑料制品廠生產(chǎn)。柴疏四君湯單次給藥和大鼠d-木糖代謝1.模型復制實驗前全部動物進行預游泳,剔除游泳時間少于10min、大于20min的大鼠。肝郁證、脾虛證和肝郁脾虛證大鼠模型的制備分別采用慢性束縛應激法、過度疲勞+飲食失節(jié)法和慢性束縛應激+過度疲勞+飲食失節(jié)法。2.分組與處理大鼠隨機分為正常對照組、肝郁模型組、肝郁給藥組、脾虛模型組、脾虛給藥組、肝郁脾虛模型組和肝郁脾虛給藥組共7組,每組8只。后6組動物分別按上述制模方法處理,連續(xù)28d;正常對照組不加任何刺激,自然飼養(yǎng)。于造模第15天,給藥各組大鼠按成人60kg體質量折算日給藥量為3.57g/kg,分別給予柴疏四君湯灌胃;各模型組和正常對照組給予等量蒸餾水,連續(xù)14d。實驗第28天禁食16h后灌服10%D-木糖溶液5mL/只,代謝籠收集各組大鼠5h的尿液,離心取上清,待測D-木糖濃度。實驗第29天(禁食不禁水12h)各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35mL/100g體質量)麻醉,結扎賁門和幽門處,1h后取胃液,置于加入0.3mol/LEDTA-2Na40μL和抑肽酶40μL抗凝劑的試管中,2000r/min離心15min,取上清;腹主動脈取血6mL,其中3mL室溫放置,2500r/min離心15min取血清;另3mL與管中預置的10%EDTA·Na230μL和抑肽酶40μL充分混勻,2000r/min離心10min取血漿;分別置于冰箱-20℃保存。3.指標觀測胃蛋白酶、D-木糖排泄率=(測試樣濃度值×稀釋倍數(shù)×5h尿樣/1000)×100%,按試劑盒比色法測定;血中GAS、MTL、SS及CCK含量,按試劑盒放免法測定。4.統(tǒng)計學方法各組指標數(shù)據(jù)均以x-±s表示,采用單因素方差分析(one-wayANOVA)后,行多組間比較,采用StudentNewmanKeulsTest檢驗。全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0forWindows軟件統(tǒng)計處理。疏肝健脾方對大鼠尿d-木糖泄漏率、胃蛋白酶及cck的影響1.疏肝健脾方對肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證模型大鼠胃蛋白酶和尿D-木糖排泄率的影響見圖1-圖2。與正常組相比,肝郁模型組大鼠尿D-木糖排泄率顯著性降低(P<0.05);脾虛模型組和肝郁脾虛模型組大鼠胃蛋白酶和尿D-木糖排泄率均顯著性降低(P<0.05);與肝郁組相比,脾虛組和肝郁脾虛組大鼠胃蛋白酶均顯著性降低(P<0.05)。各模型組大鼠給予疏肝健脾方干預2周后,較之于肝郁模型組,肝郁給藥組大鼠尿D-木糖排泄率降低、胃蛋白酶升高,但差異均無顯著性意義;較之于脾虛模型組,脾虛給藥組大鼠D-木糖排泄率顯著性升高(P<0.05);較之于肝郁脾虛組,肝郁脾虛給藥組大鼠胃蛋白酶和D-木糖排泄率均顯著性升高(P<0.05)。2.疏肝健脾方對肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證模型大鼠血中胃腸肽的影響見圖3-圖6。可以看出,與正常組相比,肝郁組和脾虛組大鼠血中GAS、MTL及CCK均顯著性降低(P<0.05),脾虛組SS顯著性升高(P<0.05);肝郁脾虛組大鼠CCK顯著性降低(P<0.05),GAS、MTL及SS均顯著性升高(P<0.05);與肝郁組相比,脾虛組和肝郁脾虛組的SS顯著性升高(P<0.05)、CCK顯著性降低(P<0.05),肝郁脾虛組MTL顯著性升高(P<0.05)。各模型組大鼠給予疏肝健脾方干預2周后,較之于肝郁組,肝郁組大鼠GAS顯著性升高(P<0.05);較之于脾虛組,脾虛組大鼠CCK顯著性升高(P<0.05),SS顯著性降低(P<0.05);較之于肝郁脾虛組,肝郁脾虛給藥組大鼠CCK顯著性升高(P<0.05),GAS、MTL及SS均顯著性降低(P<0.05)。對對不同模型消化酶的認識1.研究背景及目的肝郁、脾虛和肝郁脾虛證是中醫(yī)臨床常見的3個證型,其中肝郁脾虛證是肝郁與脾虛的復合證;柴胡疏肝散、四君子湯和柴疏四君湯(柴胡疏肝散與四君子湯合方)則分別為體現(xiàn)疏肝、健脾和疏肝健脾三法的代表方劑。根據(jù)藥-方-證-效之間的關系和中醫(yī)方證關聯(lián)的原理,同一疏肝健脾方作用于肝郁、脾虛、肝郁脾虛3個不同證候應具有不同的效應,其中疏肝健脾方對肝郁脾虛證應具有更好的療效,但目前尚缺乏實證意義上的論證。本研究根據(jù)中醫(yī)飲食勞倦傷脾、束縛受制致郁的發(fā)病學經(jīng)驗,分別采用慢性束縛、飲食失節(jié)+游泳疲勞法及其復合方法復制肝郁、脾虛和肝郁脾虛證大鼠模型,并在同步實驗條件下,考察柴疏四君子湯對3個證候模型消化系統(tǒng)有關功能的影響。2.3個相關證候模型消化系統(tǒng)異常變化的比較MTL主要由分布于十二指腸近端空腸黏膜隱窩及小腸上部的Mo細胞分泌,可刺激胃蛋白酶分泌,使胃黏膜血流量增加,對胃不同區(qū)域的肌細胞有明顯的收縮作用,促進胃排空。GAS主要由胃及十二指腸黏膜開放型G細胞分泌,可刺激胃酸、胃蛋白酶及胰酶的分泌,促進胃竇收縮功能,增加胃黏膜的流量,并能對胃腸道的黏膜起營養(yǎng)作用,促進空腹和餐后胃的運動。SS主要由胰島D細胞分泌,對胃腸系統(tǒng)有廣泛的抑制作用。CCK由小腸黏膜Ⅰ細胞釋放,其主要作用是促進胰腺腺泡分泌各種消化酶,促進膽囊收縮以排出膽汁。胃蛋白酶由胃腺的主細胞分泌,為胃液中的主要消化酶,負責水解蛋白質。D-木糖為五碳糖,口服后主要在空腸上端吸收,其吸收后在體內(nèi)不被代謝而經(jīng)腎排出,規(guī)定的時間內(nèi)尿中D-木糖的量可反映小腸的吸收功能。根據(jù)中醫(yī)肝主疏泄和脾主運化的功能內(nèi)涵,肝郁、脾虛與肝郁脾虛三證在消化系統(tǒng)功能方面的聯(lián)系密切,但三證之間有何不同,尚未見有相關報道。本實驗觀察到,肝郁模型組大鼠尿D-木糖排泄率、血中MTL、GAS及CCK均顯著降低,胃蛋白酶和SS有降低趨勢;脾虛模型組大鼠胃蛋白酶、尿D-木糖排泄率、血中MTL、GAS及CCK均顯著降低、SS顯著升高;肝郁脾虛模型組大鼠胃蛋白酶、尿D-木糖排泄率、CCK均顯著降低,但GAS、MTL和SS均顯著升高。結果表明,肝郁、脾虛、肝郁脾虛3證均存在消化系統(tǒng)功能的異常,但同中有異。結合各指標的功能,推測肝郁證以小腸吸收及胃收縮減弱、排空延長為特征,脾虛證存在胃腸消化、吸收及運動等功能全面抑制,肝郁脾虛證則存在胃腸消化吸收功能減弱及胃腸運動調節(jié)異常。進一步綜合各組指標變化及幅度,推測3證中以脾虛證的胃腸功能損傷較重,肝郁證損傷較輕。通常認為,中醫(yī)肝郁脾虛是肝郁和脾虛的復合證。但實驗觀察到,肝郁脾虛證大鼠的胃蛋白酶、尿D-木糖排泄率、CCK降低,SS升高,與肝郁證和脾虛證大鼠的相關指標變化相同,但肝郁脾虛證大鼠GAS和MTL均升高,與肝郁證和脾虛證該指標的降低則完全相反。結果提示肝郁脾虛證在病理內(nèi)涵上并不完全等同于肝郁證和脾虛證的相加。3.疏肝健脾方對不同模型消化系統(tǒng)功能作用的異同中醫(yī)認為,肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證因證情不同,宜分別選用不同功用的方劑才能取得較好的療效,即所謂的“方證對應”。柴疏四君子湯在方藥組成上含括了柴胡疏肝散和四君子湯的全部藥味,具有二方疏肝與健脾的復合功用,當其作用于在病機上具有一定同質但并不完全相同的肝郁、脾虛、肝郁脾虛3證時,其療效如何尚未見到有適宜的臨床評價。本實驗觀察到,柴疏四君子湯能升高肝郁模型大鼠血中降低的GAS,對其降低的MTL無明顯作用,但使其異常降低的CCK和D-木糖排泄率更加降低;能升高脾虛模型大鼠降低的尿D-木糖排泄率和血中CCK、降低其升高的血中SS,對其降低的胃蛋白酶、MTL和GAS無明顯作用;既能升高肝郁脾虛模型大鼠降低的胃蛋白酶活性、尿D-木糖排泄率和血中CCK,還能降低其升高的血中MTL、GAS和SS。結果顯示,同一柴疏四君子湯對3個證候模型消化系統(tǒng)功能