2023體外診斷醫(yī)療器械 核酸多重分子檢測(cè) 第1部分：核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)術(shù)語(yǔ)和通用要求

1II目 次前 言 II引 言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語(yǔ)和定義 1總則 7通則 8分析前的考慮因素 8標(biāo)本質(zhì)量的考慮因素 8核酸質(zhì)量的考慮因素 8多重分子檢測(cè)核酸質(zhì)量與評(píng)價(jià) 9多重分子檢測(cè)的核酸質(zhì)量評(píng)價(jià) 9核酸量的評(píng)價(jià) 9核酸的制備程序 105.1通則 105.2樣品準(zhǔn)備 105.2.1通則 10組織樣本制備的考慮因素 10核酸的提取和純化 11質(zhì)量評(píng)價(jià)方法 11附 錄 A（資料性）評(píng)價(jià)RNA完整性 13附 錄 B（資料性）評(píng)價(jià)DNA的完整性 14附 錄 C（資料性）利用PCR評(píng)價(jià)來(lái)源于FFPE樣品的可擴(kuò)增DNA 15附 錄 D（資料性）MicroRNA樣品 17參 考 文 獻(xiàn) 18PAGEPAGE10體外診斷醫(yī)療器械-多重核酸分子檢測(cè)第1部分：核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)術(shù)語(yǔ)和通用要求范圍同時(shí)識(shí)別兩個(gè)或更多核酸靶序列的檢測(cè)手段。本文件適用于所有的多重分子檢測(cè)方法，用于體外診斷（IVD）醫(yī)療器械和實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)（LDTs）的檢驗(yàn)，并提供核酸靶序列定性和定量檢測(cè)的信息。本文件目的為指導(dǎo)多重分子試驗(yàn)中檢測(cè)和/或定性人體臨床標(biāo)本中人類(lèi)核酸或者微生物病原體核酸注：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用的檢驗(yàn)方法稱(chēng)為“實(shí)驗(yàn)室自建方法”，“LDT”，或者稱(chēng)為“in-housetest”。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T22576.1-2018醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室——質(zhì)量和能力的要求第一部分：通用要求。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。ISO和IEC維護(hù)用于標(biāo)準(zhǔn)化的術(shù)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，地址如下：——SOp/ww.s.or/bp——IEC電子百科：http://electropedia./org3.1準(zhǔn)確度accuracy測(cè)量結(jié)果與真值之間的一致程度。注1：術(shù)語(yǔ)“準(zhǔn)確度”，當(dāng)用于一組測(cè)試或測(cè)量結(jié)果時(shí)，由隨機(jī)誤差分量和系統(tǒng)誤差分量即偏倚分量組成（ISO3534-2：2006，3.3.1）。[SOIC指導(dǎo)原則9207,,13“注釋1”“注釋2”“注釋”加了新的“注釋1”]3.2算法algorithm可用于生成合理解釋或可報(bào)告結(jié)果的檢測(cè)數(shù)據(jù)的一組規(guī)則或計(jì)算方法。3.3等位基因allele<遺傳學(xué)>控制遺傳變異的一個(gè)基因的不同形式。一個(gè)可以被替代的多態(tài)性DNADNA占據(jù)一個(gè)確定的一個(gè)基因位點(diǎn)，可以被替代的基因形式之一。3.4等位基因比例allelicratio特定等位基因（3.3）占總等位基因數(shù)量（3.3）的百分比，通常用分?jǐn)?shù)表示。（3.3）數(shù)量的40%，那么等位基因比例為注2：等位基因比例等同于等位基因頻率。3.5分析物analyte以可測(cè)量含量名稱(chēng)表示的組分。[來(lái)源：ISO17511:2020,3.1,有修改]3.6化學(xué)純度chemicalpurity表示影響多重分析的化學(xué)物質(zhì)的污染程度。注1：PCR的核酸純度是經(jīng)過(guò)提取步驟去除了有干擾作用的有機(jī)物質(zhì)和蛋白質(zhì)組分，以及核酸的污染。3.7DNA微陣列DNAmicroarrayDNA芯片DNAchip以高密度方式直接或間接集合的DNA探針陣列，可用于高通量篩選大規(guī)模生物物質(zhì)的固態(tài)基質(zhì)。[來(lái)源：ISO16578:2013,3.3]3.8文件化程序documentedprocedure執(zhí)行特定的活動(dòng)或者是文件制定、操作和維護(hù)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的過(guò)程（3.13）3.9評(píng)價(jià)方法evaluationmethod用于核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法3.10有效期expirydate截止日期expirationdate在指定條件下，確保儲(chǔ)存物質(zhì)特征性能的時(shí)間范圍上限注1：IVD試劑（3.16）、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和其他組分的有效期由制造商根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定的穩(wěn)定性（3.38）特性指定。[來(lái)源：ISO18113-1:2009,3.17,有修改]3.11外部測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品externalmeasurementstandard參考標(biāo)準(zhǔn)品referencestandard為測(cè)試多重分析方法的互換性而準(zhǔn)備的材料或物質(zhì)，其特征值是在某個(gè)科學(xué)或工程組織資助下的協(xié)作實(shí)驗(yàn)工作中得到的一致值。注1：通常針對(duì)多重分子分析。注2：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也可以作為外部測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)。[來(lái)源：ISO16578:2013,3.9,修訂——增加“注釋1”和“注釋2”]3.12預(yù)期用途intendeduse預(yù)期目的intendedpurpose體外診斷制造商在規(guī)格、使用說(shuō)明和體外診斷制造商提供的信息中給出的關(guān)于產(chǎn)品、過(guò)程或服務(wù)使用的目標(biāo)意圖。[來(lái)源：ISO18113-1:2009,3.31,修訂——?jiǎng)h除了“注釋1”和“注釋2”]5

實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)interlaboratorycomparison按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類(lèi)似的項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)量或檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)[SOIC703:01,.]體外診斷設(shè)備invitrodiagnosticinstrumentIVD設(shè)備IVDinstrument制造商用于體外診斷醫(yī)療器械的設(shè)備或儀器（3.15）[來(lái)源：ISO18113-1:2009,3.26,修訂——?jiǎng)h除了“注釋1”]體外診斷產(chǎn)品invitrodiagnosticproduct體外診斷醫(yī)療器械invitrodiagnosticmedicaldeviceIVD醫(yī)療器械IVDmedicaldevice（劑、儀器和系統(tǒng)。[來(lái)源：美國(guó)聯(lián)邦食品藥品和化妝品法案21CFR809.3]3.16體外診斷試劑invitrodiagnosticreagentIVD試劑IVDreagent被制造商預(yù)期用作體外診斷醫(yī)療器械的化學(xué)、生物學(xué)或免疫學(xué)組分、溶液或制備物（3.15）[來(lái)源：ISO18113-1:2009,3.28修訂——?jiǎng)h除“注釋1”]3.17實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)laboratorydevelopedtestsLDTs一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部設(shè)計(jì)、制造和使用，以臨床應(yīng)用為目的的體外診斷器械的形式。注1：也被稱(chēng)為“in-housetest”。[來(lái)源：CLSIQSRLDT]3.18檢出限limitofdetectionLOD由給定的測(cè)量程序得到的測(cè)得量值，對(duì)于此值，在給定聲稱(chēng)物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α?xí)r，聲稱(chēng)不存在該成分的誤判概率為β。注1：IUPAC建議α和β的默認(rèn)值等于0.05.注2：這適用于當(dāng)測(cè)試評(píng)價(jià)是否存在多種分析物(3.5)而不是多變量分子檢測(cè)(3.26)時(shí)的LOD。注3：檢出限(LOD)可以被定義為：1）在給定的置信度內(nèi)，可以被可靠測(cè)序到，并能區(qū)別于不存在的最低核酸量；2)給定樣品中可檢測(cè)到的最小等位基因組分。3.19微陣列平臺(tái)的檢出限limitofdetectionformicroarrayplatform多重分子檢測(cè)的檢出限limitofdetectionformultiplexmoleculartestplatformLODP在5%置信區(qū)間范圍內(nèi)，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)持續(xù)檢測(cè)到的外部測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品（311（或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）的（11（測(cè)定/估計(jì)注1：通常針對(duì)多重分子檢測(cè)；注2：LODP可作為一個(gè)替代多重分析檢出限（3.18）的性能指標(biāo)。[來(lái)源：ISO16578:2013,3.1,修訂——增加“注釋1”和“注釋2”]3.20大規(guī)模平行測(cè)序massiveparallelsequencing通過(guò)并行處理大量分子實(shí)現(xiàn)高通量DNA測(cè)序的方法。注1：例如，包括但不限于可對(duì)數(shù)千至數(shù)百萬(wàn)短讀長(zhǎng)（≈50至400個(gè)堿基）進(jìn)行測(cè)序的微型化和并行化的測(cè)序平臺(tái)，或基于聚合酶的可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)讀長(zhǎng)（平均長(zhǎng)度≈10,000-15,000個(gè)堿基）的實(shí)時(shí)DNA測(cè)序平臺(tái)。3.21microRNA與轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控有關(guān)的17至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈RNA3.22多重序列分析物multiplesequencesofanalyte(s)同時(shí)測(cè)量一個(gè)樣品中的多個(gè)核酸序列的成分。注1：這包括提取的核酸和基于核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的擴(kuò)增前和/或擴(kuò)增后的核酸。3.23多重分子檢測(cè)multiplexmoleculartest可以在單次分析中同時(shí)評(píng)價(jià)序列特征和/或多個(gè)（≥2個(gè)）核酸靶標(biāo)數(shù)量的體外診斷檢測(cè)，例如基于多重PCR(3.24)、多重雜交檢測(cè)、微陣列和基于大規(guī)模平行測(cè)序(3.19)的方法。注1：“多重”被定義為“通過(guò)統(tǒng)一的樣品制備、目標(biāo)或信號(hào)擴(kuò)增、等位基因（3.3）區(qū)分和信息采集同時(shí)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或更多目標(biāo)的檢測(cè)。注2：靶標(biāo)是指除了內(nèi)參以外的檢測(cè)目標(biāo)。3.24多重分子核酸檢測(cè)級(jí)別的核酸multiplexmoleculartestqualitynucleicacid(363403.25多重PCR multiplexPCR在一個(gè)反應(yīng)體系中應(yīng)用多對(duì)引物同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增子的PCR技術(shù)。[來(lái)源：ISO16577：2016，3.117]3.26多變量分子檢測(cè)multivariablemoleculartest使用解釋函數(shù)將多個(gè)變量的值組合在一起的分子檢測(cè)，它能夠產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)立的、患者特異的結(jié)果，包括“分類(lèi)”，“評(píng)分”和/或“指數(shù)”。注1：這類(lèi)檢測(cè)通?；诙嘀胤肿訖z測(cè)平臺(tái)。注2：旨在用于疾病或其他狀況的診斷，或用于治愈、緩解、治療或預(yù)防疾病。注3：統(tǒng)計(jì)詞語(yǔ)“多變量”表示對(duì)多個(gè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，而不是使用多個(gè)變量評(píng)價(jià)一個(gè)結(jié)果。3.27病原體pathogen引起宿主疾病的致病性微生物。注1：病原體包括某些病毒、類(lèi)病毒、朊病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)。[來(lái)源：ISO15714:2019,3.1.2,修訂]3.28PCR級(jí)別的DNAPCRqualityDNA具有足夠長(zhǎng)度、數(shù)量、化學(xué)純度(3.6)和結(jié)構(gòu)完整性(3.40)的，用于PCR反應(yīng)的DNA模板。[來(lái)源：ISO24276::2006,3.2.3,修訂——增加了“數(shù)量”]3.29分析前階段preanalyticalphase檢驗(yàn)前過(guò)程pre-examinationprocesses按時(shí)間順序自臨床醫(yī)生申請(qǐng)至分析檢驗(yàn)啟動(dòng)的過(guò)程，包括檢查申請(qǐng)、患者準(zhǔn)備和識(shí)別、原始樣品采集、以及在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外的運(yùn)送、分析物分離。[來(lái)源：ISO15189:2012，3.15，修訂——增加了“分析物分離”]3.30原始樣品primarysample標(biāo)本specimen一種體液或組織的分離部分，用于檢查，研究或分析一種或多種假定適用于整個(gè)人體的數(shù)量或特性。注1：全球協(xié)調(diào)工作組(GHTF)在其協(xié)調(diào)指導(dǎo)文件中用“specimen”表示醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)用生物源樣品。注2：在某些國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)和歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)文件中,“標(biāo)本”定義為“來(lái)自人體的生物樣品”。注3：在某些國(guó)家,用“標(biāo)本”代替原始樣品(或其分樣品),指準(zhǔn)備送至實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)室收到的供檢驗(yàn)用的樣品。[來(lái)源：ISO15189:2012,3.16]3.31可靠的信號(hào)范圍rangeofreliablesignal提供的與外部測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品（.10（或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）的濃度和/或拷貝數(shù)成比例的結(jié)果的能力（在給定范圍內(nèi)）注1：主要用于定量檢測(cè)，但不用于定性測(cè)試。注2：也可用于線(xiàn)性范圍或分析可測(cè)量范圍。[來(lái)源：ISO16578:2013,3.2,修訂——增加了“注釋1”和“注釋2”]3.32可報(bào)告范圍reportablerange實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)覆蓋的基因組中可接受質(zhì)量序列的區(qū)域。示例1：可報(bào)告范圍也被定義為“儀器、試劑盒或系統(tǒng)的測(cè)量結(jié)果的有效測(cè)試值范圍”（USCFR493）。3.33參考區(qū)間referencerange檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)到并可報(bào)告的正常人群中的序列變異注1：參考區(qū)間也被定義為基于健康狀況人體的一組涵蓋實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)上限和下限的值。3.34RT逆轉(zhuǎn)錄reversetranscription逆轉(zhuǎn)錄酶與RT引物、脫氧核糖核苷三磷酸結(jié)合，從RNA模板合成DNA的過(guò)程。[來(lái)源：ISO22174:2005,3.3.1]3.35逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR由兩個(gè)反應(yīng)組成的方法：從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄（3.32）并進(jìn)行PCR的過(guò)程。[來(lái)源：ISO22174:2005,3.4.2]3.36RT-PCRRNART-PCRqualityRNA具有足夠長(zhǎng)度，數(shù)量，化學(xué)純度和結(jié)構(gòu)完整性的RNA模板，適用于逆轉(zhuǎn)錄（3.32）和PCR反應(yīng)。[來(lái)源：ISO22174:2005,3.4.2，修訂]3.37樣品sample從原始樣品中取出一個(gè)或多個(gè)部分[來(lái)源：ISO15189:2012,3.24，修訂——該示例已被刪除]3.38穩(wěn)定性stability體外診斷醫(yī)療器械（3.15）在制造商規(guī)定限度內(nèi)保持其性能特性的能力注1：穩(wěn)定性適用于：當(dāng)體外診斷試劑（16、校準(zhǔn)物或質(zhì)控物在制造商規(guī)定的條件下儲(chǔ)存、運(yùn)送和使用時(shí)——按照制造商使用說(shuō)明制備、使用和貯存的復(fù)溶后凍干材料，工作溶液和從密封容器中取出的材料。注2：體外診斷試劑（3.16）或測(cè)量系統(tǒng)的穩(wěn)定性通常用時(shí)間量化：——計(jì)量性質(zhì)按規(guī)定量變化的時(shí)間間隔；——一定的時(shí)間間隔內(nèi)特征的變化。[來(lái)源：ISO18113-1:2009,3.68，修訂——在校準(zhǔn)后的測(cè)量?jī)x器或測(cè)量系統(tǒng)，注釋1和注釋3已被刪除]3.39標(biāo)本穩(wěn)定性specimenstability長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中，樣品的抗質(zhì)變能力。[來(lái)源：ISO23833:2013,5.5.10，修訂]3.40結(jié)構(gòu)完整性structuralintegrity反映核酸原始狀態(tài)的保留程度。3.41確認(rèn)validation通過(guò)提供客觀(guān)證據(jù)對(duì)特定預(yù)期用途（3.12）或應(yīng)用要求已得到滿(mǎn)足的認(rèn)定注1：“已確認(rèn)”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)[來(lái)源：ISO9000:2015,3.8.13，修訂——注釋1和注釋3已被刪除]3.42驗(yàn)證verification通過(guò)提供客觀(guān)證據(jù)，對(duì)規(guī)定要求已得到滿(mǎn)足的認(rèn)定示例1：?jiǎn)卧~“已驗(yàn)證”用于指定相應(yīng)的狀態(tài)。示例2：確認(rèn)可以包括以下活動(dòng)：——執(zhí)行替代計(jì)算——將新的設(shè)計(jì)規(guī)范與類(lèi)似的經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的設(shè)計(jì)規(guī)范進(jìn)行比較——進(jìn)行測(cè)試和演示，以及——簽發(fā)前審查文件[來(lái)源：ISO9000:2015，3.8.12，修訂——注釋1和注釋2已被改寫(xiě)]總則通則分析前的考慮因素ISO15189：2012中5.4.7和ISO/TS20658[3]ISO15189：2012，5.3。另外，ISO15189：2012、和也可能適用。分析前階段通常由以下工作流程組成：——樣品的采集、貯存和運(yùn)送；——樣品的預(yù)處理；——核酸的提取和純化。（DNA、RNA），由此造成的分析前變異可嚴(yán)重影響分析檢測(cè)結(jié)果。例如，福爾馬林固定前的熱缺血和冷缺血多重分子檢測(cè)是可同時(shí)測(cè)量?jī)蓚€(gè)或多個(gè)目標(biāo)核酸序列的IVD檢測(cè)試劑或醫(yī)療器械。多重分子檢測(cè)宜使用高質(zhì)量的樣品進(jìn)行，以確保符合檢測(cè)目的。標(biāo)本質(zhì)量的考慮因素（如果需要以確保核酸質(zhì)量適合要檢測(cè)的所有分析物或靶標(biāo)。多重核酸分子檢測(cè)用的靶標(biāo)盤(pán)包括高水平和低水平的靶標(biāo)。核酸質(zhì)量的考慮因素注：CLSIMM17-A指南提供了多重檢測(cè)的驗(yàn)證和確認(rèn)的各個(gè)方面的建議[24]多重分子檢測(cè)核酸質(zhì)量與評(píng)價(jià)多重分子檢測(cè)的核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)"PCR級(jí)別的DNA"在ISO22174、ISO16577和ISO20395中有描述。在ISO16577中，它被描述為具有足夠長(zhǎng)度、質(zhì)量和結(jié)構(gòu)完整性的DNA模板，可以通過(guò)PCR擴(kuò)增。"RT-PCR級(jí)別的RNA"也在ISO22174中有描述，為適用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR的具有足夠長(zhǎng)度和數(shù)量的RNA模板。但是，這些不適用于基于PCR、RT-PCR、微陣列和大規(guī)模平行測(cè)序中多重分子檢測(cè)的測(cè)量方法?？紤]到多重分子檢測(cè)是一種能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列甚至是長(zhǎng)度較短的核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)開(kāi)發(fā)適用于每個(gè)測(cè)量系統(tǒng)的多重分子檢測(cè)的優(yōu)質(zhì)核酸的評(píng)價(jià)方法應(yīng)被開(kāi)發(fā)?；騌NA）。用戶(hù)應(yīng)根據(jù)后續(xù)使用的多重分子檢測(cè)選擇最合適的方法。/或熒光法和/或凝（（即加入已知精確定量的目標(biāo)分析物的樣品）示例1：RNA的質(zhì)量可以通過(guò)電泳圖評(píng)價(jià)，方法是含有總RNA的樣品的28S:18S核糖體RNA的比率，RNA完整性數(shù)值（RIN值），或RNA完整性得分（RIS）[31][32]盡管基于核糖體RNA的質(zhì)量指標(biāo)常用于RNA質(zhì)量分析，但并不常用于評(píng)價(jià)信使RNA的質(zhì)量[33]。示例2：A260/A280和A260/A230的比值可以用來(lái)評(píng)價(jià)RNA的純度。PCR對(duì)于某些多重分子檢測(cè)，確保核酸樣品質(zhì)量的關(guān)鍵方面是確定目標(biāo)核酸是否存在目標(biāo)核酸。例如，對(duì)特定來(lái)源組織或生物體的低豐度核酸靶標(biāo)的多重分析宜確保樣品包含來(lái)自該組織/生物體的核酸。該注：為了提高對(duì)存活病原體的檢測(cè)，可以同時(shí)測(cè)量核糖體RNA或信使RNA。另一種方法，可以考慮用DNA嵌入劑處理細(xì)菌，該嵌入劑可穿透滅活細(xì)胞并抑制PCR擴(kuò)增，而不能穿透活細(xì)胞。示例：對(duì)于多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增（MLPA），兩個(gè)變性片段（D-片段）被用來(lái)用于指示由于DNA樣品中的鹽類(lèi)污染物導(dǎo)致的不良DNA變性。核酸量的評(píng)價(jià)根據(jù)多重分子檢測(cè)的目的應(yīng)該選擇合適的方法來(lái)評(píng)價(jià)核酸量。（核酸的制備程序通則所采用的核酸提取方法應(yīng)適合于獲得后續(xù)分析所需的核酸的質(zhì)量和數(shù)量。樣品準(zhǔn)備1：足夠數(shù)量人體細(xì)胞的黏液標(biāo)本。標(biāo)本量不足會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。為了驗(yàn)證潛在非最優(yōu)樣品導(dǎo)致的陰性結(jié)果，可同時(shí)檢測(cè)人基因組序列作為內(nèi)部對(duì)照。2：目標(biāo)分子的相對(duì)減少，從而導(dǎo)致靶序列的低估或假陰性結(jié)果。3：L-半胱氨酸和半堿性蛋白中使此現(xiàn)象降至最小化。cut-off值的定量檢測(cè)方法，對(duì)影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。1在血液感染細(xì)菌病原體多重檢測(cè)中，血液采集過(guò)程中可能發(fā)生正常人體皮膚菌群（如凝固酶陰性葡萄球菌2性，如戈登分支桿菌、龜分支桿菌或猿分支桿菌。這種情況可以通過(guò)使用無(wú)菌收集設(shè)備如支氣管鏡減少。組織樣本制備的考慮因素對(duì)于FFPE標(biāo)本，福爾馬林固定處理會(huì)造成核酸的片段化和化學(xué)修飾。因此，福爾馬林固定處理最好使用合適的固定劑，如標(biāo)準(zhǔn)福爾馬林緩沖溶液，在低溫下盡可能短時(shí)間內(nèi)完成[2][6][30]。注1：各種樣品類(lèi)型（例如FFPE，冷凍組織和血液）的檢測(cè)前工作流程在ISO20166，ISO20184和ISO20186系列中有描述[6][7][8]；注2：中性緩沖福爾馬林（NBF）通常用于固定過(guò)程；注3：從較舊的福爾馬林固定石蠟包埋塊（例如大于3年）中獲得的DNA通常顯示胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶，這可能導(dǎo)致DNA序列C：G到T：A的轉(zhuǎn)變。用尿嘧啶-N-糖基化酶處理能消除這類(lèi)樣品中含有尿嘧啶的DNA分子。另外，可通過(guò)評(píng)價(jià)大規(guī)模平行測(cè)序分析中測(cè)序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換和顛換的比例來(lái)檢測(cè)是否存在顯著的脫氨基現(xiàn)象。注：大規(guī)模平行測(cè)序分析的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)包含多態(tài)性基因組區(qū)域（如用于法醫(yī)分析的區(qū)域）可用于評(píng)價(jià)正在測(cè)序的樣品中是否存在一個(gè)以上的患者基因組。核酸的提取和純化在選擇核酸提取或純化方法時(shí)，應(yīng)考慮標(biāo)本類(lèi)型和基質(zhì)對(duì)將提取或純化的核酸在每個(gè)多重檢測(cè)中的影響。在使用某些高靈敏度的多重方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，來(lái)自試劑、純化柱和塑料器皿的核酸潛在污染可能導(dǎo)致/樣品的操作規(guī)程，并進(jìn)行記錄和遵循，從而最大程度地減少交叉污染的影響。注：部分試管材料會(huì)結(jié)合核酸。聚乙烯醇-聚丙烯材料制成的試管相較于標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯微量離心管，對(duì)DNA的吸附100ngDNA0.02%的聚乙烯醇山梨醇單月桂酸酯，可減少管壁對(duì)DNA的吸附[30]。注：當(dāng)使用珠磨法破碎真菌細(xì)胞壁或組織進(jìn)行提取時(shí)，過(guò)于激烈的提取可能導(dǎo)致核酸的斷裂。質(zhì)量評(píng)價(jià)方法60260）與280nm（A280）[31]A260/A280比值不能評(píng)價(jià)測(cè)序用的片段質(zhì)量。注：DNADNADNAA260/A280（例如2.00）不適合作為樣品純度指標(biāo)來(lái)進(jìn)行測(cè)序DNA的濃度和片段質(zhì)量料來(lái)特異性測(cè)量雙鏈DNA。A260/A280A260/A2801.60，表明該樣品中可能存在潛在的干擾化合物，如蛋白質(zhì)、酚、胍或其他試劑。在清除過(guò)量的引物/單鏈DNA等雜質(zhì)后，A260/A280比值也可用于確定PCR產(chǎn)物的純度。注：A260值也用于測(cè)量總核酸的產(chǎn)量。當(dāng)A260值異常高時(shí)，提示可能會(huì)存在基因組的污染。例如，在從血漿中測(cè)量HIV病毒時(shí)，高的A260值可能是來(lái)自白細(xì)胞的基因組DNA污染的指標(biāo)。直接評(píng)價(jià)DNA片段的斷裂狀態(tài)的方法包括電泳直接確認(rèn)、評(píng)價(jià)已知長(zhǎng)度DNA片段的PCR擴(kuò)增（例如內(nèi)部對(duì)照基因β-球蛋白或維生素DPCR中的定量循環(huán)，也稱(chēng)為循環(huán)閾值，Ct或交叉點(diǎn)，Cp）值評(píng)價(jià)擴(kuò)增反應(yīng)。測(cè)序的片段長(zhǎng)度可以通過(guò)毛細(xì)管電泳尺寸分離進(jìn)行預(yù)測(cè)或通過(guò)克隆及Sanger測(cè)序來(lái)預(yù)測(cè)。評(píng)價(jià)RNA斷裂的方法包括使用變性瓊脂糖凝膠電泳直接測(cè)量RNA的構(gòu)象。此外，可以通過(guò)核糖體NRNANA3-（APH）或β-actinRNA質(zhì)量評(píng)價(jià)，可以使用RIN值或RIS和/或由電泳得出的核糖體RNA的18S單位和28S單的比率。注1：RIN和基于核糖體RNA的質(zhì)量指標(biāo)分析并不總是對(duì)信使RNA的自然降解提供有用的指標(biāo)，尤其是對(duì)于FFPE樣品。對(duì)于來(lái)自FFPE的RNA，建議使用基于公式的石蠟包埋RNA（PERM）算法，該算法近似計(jì)算了從提取的RNA的電泳圖下的加權(quán)曲線(xiàn)區(qū)域分析。相比之下，PERM算法比RIN更好[34]。注2：RNA測(cè)序的目標(biāo)是以量化精確度來(lái)確定樣品中的RNA含量。RNA測(cè)序是通過(guò)分離靶標(biāo)的RNA分子（或選擇性去除不重要的分子），將其轉(zhuǎn)化為雙鏈cDNA，并在測(cè)序反應(yīng)中使用而實(shí)現(xiàn)的。在核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)階段使用內(nèi)部質(zhì)控可以是核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)的有用工具，估計(jì)抑制劑的影響，注：在PCR中，可以使用多重內(nèi)部擴(kuò)增質(zhì)控，其中包含多個(gè)感興趣靶標(biāo)的正向和反向引物結(jié)合區(qū)域。附錄 A（資料性）RNA通過(guò)毛細(xì)管電泳評(píng)價(jià)RNA完整性的方法包括RNA完整值RIN值和RNA完整性評(píng)分RIS值[2][31][32]RIN值是通過(guò)電泳獲得RNA片段分布大小圖譜來(lái)詳細(xì)評(píng)價(jià)RNA的完整性[2][35]。由此開(kāi)發(fā)的一種軟件算法，可以比核糖體比率方法更好地評(píng)價(jià)RNArRNARNA附錄 B（資料性）評(píng)價(jià)DNA的完整性DNA完整值（DIN）算法的開(kāi)發(fā)，目的在于提供一個(gè)評(píng)價(jià)DNA完整性的客觀(guān)標(biāo)準(zhǔn)的工具。DIN通過(guò)信號(hào)分布范圍來(lái)確定基因組DNA附錄 C（資料性）利用PCR評(píng)價(jià)來(lái)源于FFPE樣品的可擴(kuò)增DNA從福爾馬林固定的組織中提取的DNA是片段化的，并且包含DNA突變，這是序列錯(cuò)誤的來(lái)源。特別是，大量的片段化使PCR擴(kuò)增的模板量顯著減少。第二個(gè)主要問(wèn)題是FFPEDNA中出現(xiàn)錯(cuò)誤的序列，而在原始樣品中這些突變是不存在的。福爾馬林固定的組織DNA常見(jiàn)的損傷形式是DNApH值降低，組織中DNA的斷裂程度逐漸加劇。因此，即使來(lái)自不同樣品的相同量的FFPEDNA，可用于擴(kuò)增的模板量可能顯著不同，這取決于DNA的碎片損傷的程度。甲醛誘導(dǎo)的DNA交聯(lián)會(huì)降低雙鏈DNADNADNA的斷裂程度逐漸加劇[37]pHpH在FFPEDNA檢測(cè)到的序列突變中，C:G>T:A轉(zhuǎn)換是最常見(jiàn)的SNV變化類(lèi)型?；跀U(kuò)增的方法檢測(cè)拷貝數(shù)較低的F