GB∕T 18090-2023 豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法

I 2規(guī)范性引用文件 l3術(shù)語和定義 14縮略語 15生物安全措施 26臨床診斷 26.1易感動(dòng)物 26.2臨床癥狀 26.3病理變化 26.4結(jié)果判定 27實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣本采集與保存 37.1采樣器材 37.2樣本采集 37.3樣本保存 38病毒的分離與鑒定 3 38.2樣本制備 48.3試驗(yàn)方法 48.4結(jié)果判定 59反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 59.1主要器材 59.2主要試劑 59.3樣本制備 69.4試驗(yàn)方法 69.5結(jié)果判定 810實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)RT-PCR) 810.1主要器材 810.2主要試劑 810.3樣本制備 810.4試驗(yàn)方法 810.5結(jié)果判定 911免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA) 9Ⅱ11.1主要器材 11.3試驗(yàn)方法 11.4結(jié)果判定 12間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 12.1主要器材 12.3試驗(yàn)方法 12.4結(jié)果判定 13間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA) 13.1主要器材 13.2主要試劑 13.3試驗(yàn)方法 13.4結(jié)果判定 14綜合判定 附錄A(規(guī)范性)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)制備、鑒定、保存 附錄B(規(guī)范性)試劑的配制 1豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法本文件描述了豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷的方法。本文件適用于豬繁殖與呼吸綜合征的診斷和監(jiān)測(cè)。臨床診斷方法適用于PRRS臨床疑似病例的診斷，病毒分離與鑒定、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timeRT-PCR)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測(cè)，免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)適用于PRRSV抗體的檢測(cè)以及感染狀況的監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。下列縮略語適用于本文件。AEC:氨乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole)bp:堿基對(duì)(basepair)CPE:致細(xì)胞病變作用(cytopathiceffect)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EB:溴化乙錠(ethidiumbromide)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay)FITC:異硫氫酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate)HRP:辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)IFA:間接免疫熒光試驗(yàn)(indirectimmunofluorescentassay)IPMA:免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(immunoperoxidasemonolayerassay)OD:光密度(opticaldensity)PBS:磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebufferedsaline)2PRRS:豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)PRRSV:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)TMB:四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethyl5生物安全措施PRRSV的分離與鑒定應(yīng)在生物安全二級(jí)(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，按照GB19489執(zhí)行。家豬是PRRSV的易感動(dòng)物，各種年齡和品種的豬均易感，主要危害妊娠母豬和仔豬。PRRSV也毛粗亂、平均日增重降低，死亡率可達(dá)12%～20%。如果繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，可致死亡率升高。公豬豬有不同程度的呼吸系統(tǒng)癥狀，豬只生長(zhǎng)遲緩，如有細(xì)菌性繼發(fā)感染，生長(zhǎng)豬的死淘率可達(dá)5%～20%。持續(xù)性感染和亞臨床感染豬無明顯臨床表現(xiàn)。6.2.3非典型：以高熱、高發(fā)病率和死亡率為特征。妊娠母豬的流產(chǎn)率為40%～100%,死亡率可達(dá)10%以上，哺乳仔豬的死亡率可高達(dá)100%,保育豬的死亡率可達(dá)50%以上。6.3.1剖檢病理變化：感染豬肺臟輕度或中度水腫，呈橡膠樣，大部分淋巴結(jié)腫大。高致病性PRRSV6.3.2組織病理學(xué)變化：肺臟呈典型的間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔增厚、單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及Ⅱ型6.4.1出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可初步判定為疑似PRRS。6.4.2確診應(yīng)按照NY/T541規(guī)定的要求采集豬的全血、血清及肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。37實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣本采集與保存7.1采樣器材用注射器無菌采集發(fā)病豬或感染豬血液，凝固后分離血清，或采集抗凝血，經(jīng)離心分離出血漿。血清、抗凝血或血漿可用于PRRSV的分離與鑒定、RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測(cè)。血清可用于PRRSV抗體檢測(cè)，豬群PRRSV抗體的監(jiān)測(cè)應(yīng)采集至少30頭豬的血清樣本。公豬的精液可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測(cè)。將綿繩懸掛于豬欄，讓豬咬綿采集的樣本應(yīng)保存于4℃,用于病毒分離的樣本應(yīng)在24h～48h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。不能立即進(jìn)行檢測(cè)的樣本應(yīng)保存于一20℃冰箱，長(zhǎng)期保存應(yīng)置于—70℃冰箱。8病毒的分離與鑒定8.1.1.3倒置生物顯微鏡。8.1.1.5離心機(jī)及離心管(規(guī)格10mL)。8.1.1.696孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板。8.1.1.8組織研磨器。48.1.2.1細(xì)胞生長(zhǎng)液與維持液，按照附錄A中A.1.1配制。豬原代肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)或MARC-145細(xì)胞。PAMs按照附錄A進(jìn)行制備、保存與復(fù)蘇。應(yīng)血清、全血或血漿樣本可直接用于病毒分離。組織樣本經(jīng)剪碎后經(jīng)組織研磨器研磨，按照1:9的比例加入RPMI1640培養(yǎng)基制成10%的組織懸液，經(jīng)3000r/min離心15min后，吸取上清液，加入青霉素(500IU/mL)、鏈霉素(500μg/mL)、慶大霉素(500μg/mL)和兩性霉素B(200μg/mL)。有細(xì)菌污染的樣本應(yīng)用微孔濾器進(jìn)行過濾處理。用RPMI1640細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋復(fù)蘇的PAMs,細(xì)胞終濃度為每毫升1×10?個(gè)/mL細(xì)胞，或用DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋MARC-145細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為每毫升5×10?個(gè)細(xì)胞。然后，將稀釋的細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μL/孔，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長(zhǎng)成單層。在空白的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640,90μL/孔，在A排和E排各孔內(nèi)分別加孔(樣本1:10稀釋，重復(fù)2孔),搖動(dòng)培養(yǎng)板后，從A排和E排孔各取10μL分別移入B排和F排孔內(nèi)(樣本1:100稀釋)。搖動(dòng)培養(yǎng)板后，再?gòu)腂排和F排孔各取10μL分別移入C排和G排孔內(nèi)(樣本1:1000稀釋)。同樣，再?gòu)膹腃排和G排孔各取10μL分別移入D排和H排孔內(nèi)(樣本1:10000稀釋)。每個(gè)培養(yǎng)板應(yīng)設(shè)置不接種樣本的細(xì)胞空白對(duì)照。一般而言，對(duì)用于PRRSV分離的樣本進(jìn)行1:10和1:100稀釋即可。吸取按8.3.2方法稀釋的樣本50μL接種于8.3.1中對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔(第1代)中，吸附1h后，加入細(xì)樣本初次接種細(xì)胞培養(yǎng)2d后，不論有無CPE,應(yīng)將每孔內(nèi)細(xì)胞液取25μL,移入按照8.3.1制備的新細(xì)胞板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)(第2代),置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～5d,每天觀察CPE。樣本的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)盲傳2代～3代。用PRRSV陽性血清或單克隆抗體，采用本文件的免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)或間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA),對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)物進(jìn)行PRRSV的鑒定。58.4.1PRRSV感染細(xì)胞的CPE主傳后均出現(xiàn)CPE,或盲傳后出現(xiàn)CPE,并經(jīng)IPMA或IFA檢測(cè)為陽性，判定為PRRSV分離陽性。8.4.2初次接種樣本和盲傳后均無CPE,或出現(xiàn)CPE但經(jīng)IPMA或IFA檢測(cè)為陰性，判為PRRSV分9反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)9.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(4℃,離心速度12000r/min以上)。9.1.3穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。9.1.5混勻器。9.1.7微量可調(diào)移液器(規(guī)格100μL～1000μL、濾芯吸頭。9.1.8組織研磨器。9.2.1除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，所用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格，所有試劑均用無RNase污染的容器分裝。9.2.2PBS液，按照附錄B中B.1配制。9.2.3商品化的RNA提取裂解液。9.2.4三氯甲烷。9.2.5異丙醇(一20℃預(yù)冷)。9.2.6DEPC水：在100mL三蒸水中加入100μLDEPC,18℃~22℃室溫下過夜，121℃滅菌15min。也可用商品化的產(chǎn)品。9.2.775%乙醇：75mL無水乙醇加25mLDEPC水，配制成75%乙醇溶液，-20℃預(yù)冷備用。9.2.15甘油或礦物油。9.2.16引物，檢測(cè)PRRSV的引物對(duì)序列見附錄C,加DEPC水配制成100μmol/L的儲(chǔ)存濃度和69.2.19電泳上樣緩沖液：100mL溶液中含0.25g溴酚藍(lán)及40g蔗糖。取待檢組織樣本2.0g于滅菌的組織研磨器中充分研磨，加10mLPBS混勻，4℃3000r/min離心15min,取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)。取精液0.5mL,經(jīng)凍融2次或進(jìn)行超聲波裂解，10000r/min離心10min,取上清液。直接使用。加入200μL三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5s。于4℃經(jīng)12000r/min離心15min。9.4.1.2取與9.4.1.1相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇。吸取9.4.1.1各管中的上9.4.1.3于4℃經(jīng)12000r/min離心15min,小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入9.4.1.4于4℃、12000r/min離心10min,小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。9.4.1.54000r/min離心10s,將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥9.4.1.6加入11μLDEPC水，輕輕混勻，以溶解管壁上的RNA,200提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，否則應(yīng)置于一70℃冰箱保存。反應(yīng)液總量20μL。依次在RT反應(yīng)管中加入RNA模板和試劑：a)RNA模板：提取樣本的總RNA,5μL;b)下游引物P2,1μL;g)DEPC水，6μL。經(jīng)4000r/min離心20s后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT的反應(yīng)條件：50℃,30min。用于檢測(cè)PRRSV的通用引物序列見附錄C,PCR反應(yīng)體系見表1。7加樣次序試劑成分體積/pL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物210×PCR緩沖液345上游引物P1(20μmol/L)6下游引物P2(20μmol/L)7Taq酶(5U/μL)8將表1中的試劑充分混勻，4000r/min離心30s。PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s,35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。若采用一步法RT-PCR,則省略9.4.2,用提取的RNA直接進(jìn)行反應(yīng)。一步法RT-PCR反應(yīng)體系見表2,用于檢測(cè)PRRSV的通用引物序列見附錄C。加樣次序試劑成分體積/μL1210×PCR緩沖液345上游引物P1(20μmol/L)6下游引物P2(20μmol/L)7反轉(zhuǎn)錄酶8Taq酶(5U/μL)9一步法RT-PCR的反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min;94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖(含0.5μg/mLEB)凝膠。將凝膠放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面，將6μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL電泳上樣緩沖液混勻后加入樣本孔。電泳時(shí)應(yīng)設(shè)立DNAMarker對(duì)照。按5V/cm進(jìn)行電泳20min～30min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。89.5.1試驗(yàn)成立條件：PRRSV-1(歐洲型)陽性對(duì)照有大小為398bp的特異性擴(kuò)增條帶；PRRSV-2(美洲型)陽性對(duì)照有大小為433bp的特異性擴(kuò)增條帶；陰性對(duì)照和空白對(duì)照無任何擴(kuò)增條帶。9.5.2被檢樣本有大小為398bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對(duì)照條帶大小相符，則判為PRRSV-1核酸陽性。9.5.3被檢樣本有大小為433bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對(duì)照條帶大小相符，則判為PRRSV-2核酸陽性。9.5.4被檢樣本同時(shí)有大小為398bp和433bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對(duì)照條帶大小相符，則判9.5.5被檢樣本無大小為398bp或433bp特異性的擴(kuò)增條帶，則樣本判為PRRSV核酸陰性。必要時(shí)，可取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并與已公開發(fā)表的PRRSV特異性片段序列進(jìn)行同10.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(4℃,離心速度12000r/min以上)。10.1.3混勻器。10.1.4冰箱(2℃~8℃和-20℃)。帶濾芯吸頭。濃度。9分別使用C.4和C.5中的引物和探針，檢測(cè)PRRSV-1和PRRSV-2。實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)體系見表3。各種試劑充分混勻，2000r/min離心2min。將15μL實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)混合液加入PCR反應(yīng)熒光PCR儀中。每次進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)均應(yīng)設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。試劑成分儲(chǔ)存液濃度終濃度體積/μl.RT-PCR緩沖液5MgCl?25mmol/L2.5mmol/LdNTPs0.2mmol/L上游引物下游引物探針0.255U/μL0.1U/μL5U/μL0.1U/μL4.75退火30s,72℃延伸1min,5個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，92℃變性10s,60℃退火延伸30s,40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增階段每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。10.5.1試驗(yàn)成立條件：陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)<28且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照應(yīng)無Ct值或10.5.2被檢樣本Ct值≤30且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽性；當(dāng)無Ct值或Ct值≥40,判為陰性；當(dāng)30<Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為疑似。對(duì)疑似樣本，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，Ct值<40且出現(xiàn)特11免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)11.1主要器材11.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清和HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物。使用前用血清稀釋液稀釋至工作11.3.1稀釋血清樣本：在空板的A排和E排各孔分別加入180μL的血清稀釋液，其余各孔加120μL。將20μL被檢血清和對(duì)照血清分別加入A排和E排各孔(1:10稀釋),搖動(dòng)混勻；從A排和E排各孔內(nèi)取40μL分別加入B排和F排孔，依次做1:40、1:160、1:640稀釋。11.3.2取上述板中稀釋血清樣本各50μL加入IPMA診斷板的相應(yīng)孔內(nèi)，封板后37℃孵育1h,棄去液體，用0.15mol/mLNaCl(含0.5%吐溫-80)洗板3次。11.3.3用0.15mol/LNaCl(含0.5%吐溫-80)稀釋HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物為工作濃度，加入50μL結(jié)合物稀釋液于板的孔中，封板后37℃孵育1h,洗滌3次。11.3.4在各孔中加入顯色劑/底物溶液(AEC-H?O?)(按照B.5.1配制)50μL,在18℃~22℃室溫下11.4.1試驗(yàn)成立條件：將IPMA診斷板置于倒置生物顯微鏡下觀察。陽性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色的特異性染色，陰性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)不被染色。11.4.2被檢血清樣本孔30%～50%的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色，判定為免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)陽性(IPMA+);細(xì)胞質(zhì)未被染色，判定為免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)陰性(IPMA一)。與陽性血清對(duì)照相比，若整孔細(xì)胞被染色，則視為血清樣本的非特異性反應(yīng)。血清滴度以50%以上的孔染色的最高稀釋度的倒數(shù)表示。血清樣本的滴度<10判定為陰性；血清樣本的滴度為10或40判定為弱陽性，非特異性染色常在此范圍內(nèi)；血清樣本的滴度≥160判定為陽性。12間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)12.1.2倒置熒光顯微鏡。12.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清和FITC-兔抗豬IgG結(jié)合物。12.3.1在96孔板中每孔加入PBS液190μL,再分別加入待檢血清、陽性血清、陰性血清10μL(1:2012.3.2取出IFA診斷板。加入150μLPBS,室溫浸潤(rùn)5min,棄去板中液體，在吸水紙上輕輕拍干。12.3.4棄去板中血清，在吸水紙上輕輕拍干。每孔加入PBS液200μL,棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗板6次。12.3.5每孔加入工作濃度的FITC-兔抗豬IgG結(jié)合物50μL,置濕盒中37℃作用30min。12.3.6棄去板中結(jié)合物，用PBS洗滌4次后，最后在吸水紙上輕輕拍干。12.3.7將IFA診斷板置于倒置熒光顯微鏡下觀察。12.3.8血清滴度的測(cè)定：將血清樣本進(jìn)行4倍倍比稀釋(1:20、1:80、1:160、1:320等),按上述方法進(jìn)行IFA檢測(cè)。12.4.1試驗(yàn)成立條件：陽性血清對(duì)照中感染細(xì)胞孔細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)典型的黃綠色特異性熒光，而未感染細(xì)胞孔無熒光；陰性血清對(duì)照中感染細(xì)胞孔和未感染細(xì)胞孔細(xì)胞質(zhì)均不出現(xiàn)熒光。12.4.2被檢血清的感染細(xì)胞孔細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)特異性黃綠色熒光，而未感染細(xì)胞孔不出現(xiàn)熒光，判定為陽性；被檢血清的未感染細(xì)胞和感染細(xì)胞孔細(xì)胞質(zhì)均無特異性黃綠色熒光，判定為陰性。若血清樣本在1:20稀釋時(shí)出現(xiàn)可疑結(jié)果，應(yīng)重新檢測(cè)，或2周～3周后重新采樣進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)仍為可疑，應(yīng)綜合考慮其他檢測(cè)方法結(jié)果進(jìn)行判定。血清樣本感染細(xì)胞孔呈現(xiàn)特異性熒光的最高稀釋度的倒數(shù)表示為13間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)13.1.196孔平底聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板。13.2.1PRRSV抗原：提純的PRRS13.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清、HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物。使用前用稀釋液稀釋至工作也可使用商品化的檢測(cè)PRRSVN蛋白抗體的試劑盒。13.3.1用抗原稀釋液將PRRSV抗原稀釋成工作濃度，加入96孔反應(yīng)板中，每孔100μL,封板后置濕盒內(nèi)37℃恒溫箱中感作60min,然后置4℃冰箱內(nèi)過夜。13.3.4同13.3.2進(jìn)行洗滌。若使用商品化的ELISA試劑盒，無上述操作步驟。血清稀釋液，進(jìn)行1:40稀釋。在PRRSV抗原包被反應(yīng)板中加入稀釋的被檢血清、陽性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照，每孔100μL。陽性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照各加入相鄰的2個(gè)孔，每份血清樣本加1孔。封板后置濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。13.3.6同13.3.2進(jìn)行洗滌。13.3.7加入工作濃度的HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物，100μL/孔，封板后置濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。13.3.8同13.3.2洗滌。13.3.9加入新配制的顯色/底物溶液(TMB-H?O?),100μL/孔，封板后在37℃恒溫箱中避光反應(yīng)13.3.10加入反應(yīng)終止液(1mol/L氫氟酸溶液或10%SDS溶液),100μL/孔，終止反應(yīng)。13.3.11光密度(OD)值測(cè)定：在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上讀取反應(yīng)板各孔波長(zhǎng)450nm(氫氟酸終止)或650nm(SDS終止)的OD值。PPNN圖1酶標(biāo)反應(yīng)板對(duì)照和樣本分布圖13.4.1試驗(yàn)成立條件：陽性血清對(duì)照平均OD值與陰性血清對(duì)照平均OD值的差值≥0.15時(shí)，試驗(yàn)成立。否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。13.4.2計(jì)算血清樣本的S/P比值。若被檢血清樣本的S/P比值≥0.4,判定為PRRSV抗體陽性。被檢血清樣本的S/P比值<0.3,判定為PRRSV抗體陰性。0.3≤被檢血清樣本的S/P比值<0.4,判定為可疑；對(duì)可疑樣本重復(fù)檢測(cè)一次，若仍為可疑，則可判定為陽性。血清樣本S/P比值的計(jì)算公式：S/P=(樣本OD值一陰性血清對(duì)照平均OD值)/(陽性血清對(duì)照平均OD值一陰性血清對(duì)照平均OD值)。14綜合判定14.1PRRS的診斷方法有多種，當(dāng)在臨床上懷疑PRRS或PRRSV感染時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況選用上述方法中的一種或兩種進(jìn)行確診。對(duì)于未接種過PRRS活疫苗的豬，當(dāng)病毒分離與鑒定試驗(yàn)為陽性時(shí)，可判定為PRRSV感染陽性；對(duì)于接種過PRRS活疫苗的豬，當(dāng)病毒分離與鑒定試驗(yàn)為陽性時(shí)，如果豬有臨床癥狀，可判定為PRRSV感染；如果豬無臨床癥狀，應(yīng)進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定，以區(qū)分疫苗毒株或野毒株感染。RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR方法適用于PRRSV感染的快速診斷，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果用于PRRS新疫區(qū)的確定時(shí)，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行病毒分離與鑒定。IPMA、IFA和間接ELISA適用于發(fā)病豬的群體診斷，但不能區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬。14.2依據(jù)臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，符合6.2、6.3的任何一項(xiàng)，可判為疑似PRRS。14.3符合6.2、6.3的任何一項(xiàng)，并且第8章～第13章的六種診斷方法中任何一項(xiàng)為陽性，可診斷為PRRS。14.4對(duì)于未接種過PRRS疫苗的豬，第8章～第13章的六種診斷方法中任何一項(xiàng)為陽性，均可判定為PRRSV感染；對(duì)于接種過PRRS滅活疫苗的豬，第8章～第10章的三種診斷方法中任何一項(xiàng)為陽(規(guī)范性)A.1.1細(xì)胞生長(zhǎng)液與維持液細(xì)胞生長(zhǎng)液：加入10%犢牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基(含1%谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL、兩性霉素B10μg/mL,pH7.2)。細(xì)胞維持液：加入5%犢牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基(含1%谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL、兩性霉素B10μg/mL,pH7.2)。A.1.2細(xì)胞凍存液細(xì)胞生長(zhǎng)液與二甲基亞砜(DMSO)按照8:2的比例混勻。取6周齡～8周齡的SPF豬或被證實(shí)無PRRSV感染的健康豬，動(dòng)脈放血致死，立即無菌操作取肺臟，切勿劃破被膜。約200mLPBS液從氣管灌入肺臟，擠壓灌洗3次～4次，收集灌洗液，1000r/min離心10min,棄上清液，沉淀物用50mLPBS液再懸浮和離心洗滌2次～3次。最后的細(xì)胞泥用50mL細(xì)胞生長(zhǎng)液懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所得新鮮巨噬細(xì)胞應(yīng)立即使用或分裝后凍存。A.3PAMs的凍存取細(xì)胞濃度為6×107/1.5mL的細(xì)胞懸液，加入等量細(xì)胞凍存液，緩慢滴加，邊加邊振搖。用細(xì)胞凍存管分裝，每管1.5mL,放一70℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮中保存。液氮保存不同批次的巨噬細(xì)胞，不可混用。從液氮中取出冷凍細(xì)胞管，立即投入溫水(37℃左右)中迅速解凍。將細(xì)胞移入10倍量的RP-MI1640液(pH7.2)中，1000r/min離心10min,棄上清液，沉淀的細(xì)胞用細(xì)胞生長(zhǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)，稀釋至要求的細(xì)胞濃度后，即可使用。A.5PAMs的批次試驗(yàn)每批巨噬細(xì)胞應(yīng)檢驗(yàn)合格后再使用。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上用已知滴度的標(biāo)準(zhǔn)病毒感染巨噬細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)的陽性血清和陰性血清進(jìn)行IPMA或IFA測(cè)定。只有能支持特定滴度(TCIDso)的標(biāo)準(zhǔn)病毒良好生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞，方可用于試驗(yàn)。A.6IPMA診斷板的制備IPMA診斷板的制備步驟如下