木豆葉總芪對高脂模型兔脂質代謝的影響

木豆葉總芪對高脂模型兔脂質代謝的影響

根據(jù)大量研究，高血壓是中風、冠狀動脈粥樣硬化、心臟病和猝死的危險因素。降脂治療可逆轉動脈粥樣硬化病變的發(fā)生,顯著降低心血管疾病所致的死亡和相關事件。從藥用植物中尋找具有降脂作用的天然產(chǎn)物,成為近年來的研究熱點。木豆(CajanuscajanL.)生長在我國南部的多個省份,屬于木豆科木豆屬,為多年生常綠灌木。本實驗前期的研究首次發(fā)現(xiàn)并證實木豆葉總芪可以降低高脂模型小鼠血脂水平和肝臟脂質蓄積。在研究高脂血癥及動脈粥樣硬化的發(fā)病機制以及調脂藥和抗動脈硬化藥物時,建立典型的動物模型十分重要,非嚙齒類動物兔在建立高脂血癥模型中最為常用,被推薦為有關調血脂藥和抗動脈粥樣硬化藥研究的主要動物。所以本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)復制高脂血癥兔模型,首次觀察木豆葉總芪(TSC)對高脂模型兔脂質的影響。細胞內膽固醇的外流可以減少細胞膽固醇的蓄積,從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生和進展。ATP結合盒轉子A1(ATP-BindingCassetteTransporterA1,ABCA1)所介導的膽固醇的逆轉運(reverecholesteroltransport,RCT)是膽固醇外流的初始步驟,其在RCT過程中起著重要的作用。本實驗通過觀察TSC對RCT和ABCA1蛋白表達的影響,進一步探討了TSC降脂作用的可能機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物飼養(yǎng)動物顯示普通級健康純種雄性新西蘭白兔36只,3月齡,體質量(2.21±0.22)kg,購自中國醫(yī)學科學院動物研究所(合格證號0160214),分籠飼養(yǎng),飲水不限;THP-1細胞來源于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心,為人來源的單核白血病細胞系。1.1.2木豆葉總治療木豆葉采自廣西省,鑒定人為林雨霖教授,標本保存地點為中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所。木豆葉總芪由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所化學室斯建勇教授提供。將木豆葉經(jīng)乙醇回流提取3次,依次以乙烷和二氯甲烷萃取,結晶析出后過濾得木豆葉總芪。主要含有木豆素、木豆素C和木豆素A3種芪類化合物,質量比為4∶1∶0.26;血脂康(北京北大維信生物科技有限公司)。1.1.3抗人abca1和辣根過氧化物酶標記羊抗菌體的檢測總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);[3H]膽固醇(GE公司);PMA和apoA1(Sigma公司);小鼠抗人ABCA1抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠抗體(IgG)(SantaCruz公司);小鼠抗人β-actin抗體(北京中山金橋生物技術有限公司)。1.2方法1.2.1量情況隨機分組所有動物適應性喂養(yǎng)1周,穩(wěn)定后記錄體質量并進行基線血脂測定,根據(jù)血清TC水平和體質量情況隨機分為6組,即空白對照組(control)、高脂模型組(model)、血脂康組(Xuezhikang)、木豆葉總芪高劑量組(TH)、木豆葉總芪中劑量組(TM)和木豆葉總芪低劑量組(TL),每組6只。各組之間血清TC和體質量水平無統(tǒng)計學差異。1.2.2普通飼料及造模采用喂食高脂飼料的方法建立兔高脂模型?？瞻讓φ战M每日給予普通飼料,其余各組每日每只給予高脂飼料120～150g(豬油10%,蛋黃粉7.5%,膽固醇1%,普通飼料81.5%),造模時間14d。1.2.3給藥劑量及給藥方式高脂2周后測血脂水平,觀察高脂模型建立成功后,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)并開始灌胃給藥。木豆葉總芪高、中、低劑量組分別給予200、100和50mg/kg,血脂康組給予0.12g/kg。每天1次,共24d。每周稱體質量1次,以調整給藥劑量。所有藥物均以30%乙醇作為溶劑制作藥物混懸液?？瞻讓φ战M和高脂模型組以等量溶劑灌胃。1.2.4肝臟生化指標的測定實驗開始前及以后的2、6周,空腹禁食12h(不禁水)后于清晨從耳緣靜脈取血2mL,分離血清,置-20℃冰箱保存。按試劑盒說明測定TC、TG、HDL-C及LDL-C水平。第6周末,耳緣靜脈注入空氣法處死全部動物,摘取各組動物肝臟,0.9%氯化鈉注射液洗凈,吸干并稱濕重,液氮速凍后-80℃保存。配置Folch液(氯仿∶甲醇為2∶1),采用Folch法提取各組兔肝臟中的脂質并測定。1.2.5肝臟組織的準備和觀察取肝臟正中葉相同部位的組織,4%多聚甲醛固定,進行常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察肝臟組織形態(tài)學及病理學改變。1.2.6細胞培養(yǎng)模式THP-1細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含青霉素100U/mL,鏈霉素100U/mL),在細胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng),每2～3d換液。1.2.7血清rpmi1340將佛波酯(PMA)存儲液加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,使PMA終濃度為100ng/mL。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48h,誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞。1.2.8細胞培養(yǎng)及檢測膽固醇流出分析按文獻描述的方法進行,THP-1細胞經(jīng)PMA(100ng/mL)誘導48h后分化為巨噬細胞,加入含有7.4×103Bq/mL[3H]膽固醇的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基共孵育48h。棄去上清,PBS清洗細胞3次,細胞分為對照組、C03高劑量組(CH,3×10-5mol/L)、C03中劑量組(CM,3×10-6mol/L)、C03低劑量組(CL,3×10-7mol/L)和雌二醇組(E2,1×10-7mol/L),分別加入含有不同濃度C03或E2的含2mg/mL牛血清白蛋白的無血清RPMI1640培養(yǎng)基,正常組加入與E2等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)基。24h后棄去每孔中液體,PBS重復洗2次,加入含有apoA-I(10μg/mL)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)作用12h。用閃爍計數(shù)法測定上清和細胞內[3H]膽固醇,記為每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。膽固醇流出率(%)=(上清液CPM值/上清液CPM值+細胞裂解液的CPM值)×100%。1.2.9sds-東南角電泳膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白,棄去細胞培養(yǎng)液,PBS清洗3次,在無酶細胞消化液冰浴消化10min后輕柔刮取收集細胞,細胞超聲粉碎后,14000r/min離心15min,收集細胞膜蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白含量,取等量蛋白(25μg)進行SDS電泳,電轉至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜,用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h,TBST洗膜后以ECL發(fā)光試劑盒顯影并曝光。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析計量資料用均數(shù)±標準差(—x±s)(x—±s)表示,所有實驗數(shù)據(jù)均輸入SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,所有結果采用(ONE-WAYANOVA)分析進行統(tǒng)計。2結果2.1肝臟濕重的變化模型組兔肝臟干濕重均顯著高于對照組(P<0.01);相比模型組,TSC和血脂康組兔肝臟濕重并無下降趨勢。各組均取濕重1g的肝臟,烘干后稱干重,TH、血脂康和TM干預后肝臟干重均較模型組明顯降低(P<0.01和P<0.05),且TSC組肝臟干重隨劑量增加而下降,顯示TSC可明顯降低高脂血癥兔的肝臟干重(表1)。2.2tsc和血脂康干預前后肝臟血脂指標比較高脂模型組兔肝臟中TC和TG含量顯著高于對照組(P<0.01),表明高脂飲食可以升高動物的肝臟脂質水平。TSC和血脂康干預后肝臟內脂質含量均較模型組明顯降低,TSC組的肝臟TC和TG水平隨用藥劑量的增加而下降。TH組兔肝臟中TC和TG含量與模型組相比,分別降低了36.0%和38.0%(均P<0.01),表明木豆葉總芪提取物可以抑制肝臟脂質的蓄積(表2)。2.3木豆葉總細化對小鼠血清tc和tg水平的影響實驗前各組間血脂無明顯差異;實驗2、6周模型組的TC、TG水平顯著高于對照組(P<0.01),表明高脂模型建立成功;給藥后,TSC各組、血脂康組與模型組相比,血脂水平均有一定下降,且TSC組的血清TC和TG水平隨用藥劑量的增加而下降。與模型組相比,TH組的TC和TG顯著降低,分別減少了35.4%和12.3%(P<0.01和P<0.05),顯示木豆葉總芪200mg/kg可明顯降低異常升高的血清TC和TG。模型組的血清LDL-C水平明顯高于對照組(P<0.01),而TH、血脂康組和TM、TL組的LDL-C水平顯著低于模型組(P<0.01和P<0.01),其中TH、TM、TL組的LDL-C含量比模型組各自下降了29.1%、7.9%和7.7%,表明木豆葉總芪具有明顯降低血清LDL-C的作用(P<0.01)(表3)。2.4木豆葉總治療肝臟病理的組織病理學觀察肉眼觀察對照組兔肝臟為鮮紅色,邊緣銳利,表面光滑,切面無顆粒感;其他各組動物肝臟形態(tài)變化相似,體積均明顯增大,包膜緊張,質地油膩。高脂模型組肝臟顏色呈暗黃色,木豆葉總芪高劑量組肝臟顏色較模型組淺,但比對照組深。光鏡下觀察:(1)對照組:肝小葉完整,輪廓清晰,肝細胞呈條索狀排列,核圓規(guī)整,細胞圍繞中央靜脈呈放射狀,匯管區(qū)基本結構清晰可見(圖1A)。(2)高脂模型組:肝細胞腫脹,細胞排列紊亂,充滿大小不等的脂肪空泡,空泡大者可將肝細胞核推向一側,含脂肪的肝細胞可破裂或融合成脂肪囊腫(圖1B)。(3)木豆葉總芪高、中及低劑量組:與模型組肝細胞相比腫脹程度減輕,脂肪空泡少。且隨用藥劑量增加,肝細胞脂質蓄積改善越明顯(圖1C,D,E)。(4)血脂康組:與模型組相比,肝細胞腫脹程度明顯好轉,脂肪空泡減少(圖1F)。2.5醇上傳率測定C03與THP-1細胞共同孵育24h后,可以增加THP-1細胞[3H]膽固醇流出率,且該作用同樣具有劑量依賴性。與對照組比較,C03高劑量組細胞[3H]膽固醇流出率增加了55.39%(P<0.01),表明C03能夠調節(jié)巨噬細胞的膽固醇代謝,增加膽固醇由巨噬細胞內向外流出,減少細胞內膽固醇蓄積(表4)。2.6木豆葉總針c03對tp-1mcclovac細胞apa1蛋白的形成有影響3不同途徑木豆葉總治療肝臟功能血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平與動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生呈明顯負相關,HDL-C拮抗AS的最主要機制在于參與膽固醇逆向轉運(RCT)過程。RCT促進外周組織和巨噬細胞等細胞內膽固醇轉運到肝臟進行代謝,降低血漿膽固醇水平,減少細胞內脂質蓄積,進而抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。在RCT過程中,ABCA1是調節(jié)細胞內膽固醇外流的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗中高脂飼料喂養(yǎng)后兔血脂水平顯著升高,表明高脂模型建立成功。動物實驗結果提示,木豆葉總芪可以顯著降低高脂模型兔血清和肝臟TC、TG水平及血清LDL-C水平;另外,觀察到木豆葉總芪對肝臟濕重的降低作用不明顯,卻對肝臟干重降低作用明顯,推測可能與肝細胞存在不同程度的細胞腫脹和水樣變性有關,同時提示木豆葉總芪可以降低肝臟質量。病理結果提示木豆葉總芪各組肝細胞脂肪變性情況明顯好轉,且隨用藥劑量的增加,肝細胞脂質蓄積改善越明顯,表明木豆葉總芪對高脂模型兔脂質代謝紊亂有良好的改善作用;細胞實驗結果提示木豆葉總芪單體成分C03可劑量依賴性上調THP-1巨噬細胞ABCA1表達,進而促進巨噬細胞內膽固醇外流,降低血脂及肝臟脂質水平。通過上述結果可知,木豆葉總芪對高脂飼料喂養(yǎng)的高脂血癥兔脂質有降低作用,其降脂機制可能是通過增強細胞ABCA1表達,促進巨噬細胞內膽固醇外流,啟動RCT過程有關。木豆葉總芪能夠改善體內紊亂的脂質代謝,并具有治療動脈粥樣硬化和脂肪肝等疾病的潛在作用。本研究結果為進一步探討木豆葉總芪影響膽固醇代謝的作用機制奠定了基礎。各組THP-1巨噬細胞在給予不同濃度C03和E2作用24h