融合蛋白標(biāo)簽

在蛋白質(zhì)功效及構(gòu)造研究過程中，研究的首要任務(wù)就是運用多個辦法獲得純化的含有完整構(gòu)造及生物學(xué)功效并能夠?qū)Φ恼郫B的高度純化蛋白質(zhì)。除了蛋白質(zhì)的研究，含有特定生物活性的高價值蛋白質(zhì)的生產(chǎn)也需要對蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行純化。因此，科研人員和工業(yè)生產(chǎn)往往大量采用多個多樣的體現(xiàn)系統(tǒng)來獲得高體現(xiàn)的蛋白質(zhì)，對其純化后進(jìn)行研究或加工，這些體現(xiàn)系統(tǒng)涉及原核體現(xiàn)系統(tǒng)、酵母菌體現(xiàn)系統(tǒng)、昆蟲動物細(xì)胞體現(xiàn)系統(tǒng)、真核細(xì)胞體現(xiàn)系統(tǒng)等。如何將系統(tǒng)中體現(xiàn)的目的蛋白質(zhì)與其它蛋白分離，始終是體現(xiàn)純化中的一種重點。為了克服從復(fù)雜樣品中純化單一蛋白質(zhì)這種困難，科學(xué)家運用生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，含有識別某種特定物質(zhì)并與該物質(zhì)分子特異性結(jié)合的能力，運用生物分子間的這種特異性結(jié)合能力而形成的親和純化技術(shù)。親和標(biāo)簽純化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白的分離純化中。在重組蛋白的親和純化中，運用基因工程技術(shù)，將通過改造優(yōu)化的親和標(biāo)簽與目的蛋白融合體現(xiàn)，通過一步簡樸快速的親和層析，直接獲得純度較高的重組融合蛋白，已成為重組蛋白純化的一種通用辦法，含有結(jié)合特異性高、純化環(huán)節(jié)簡便、純化條件溫和、合用性廣泛等優(yōu)點，為蛋白質(zhì)的有效純化提供了一條解決的途徑，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)造與功效的研究及重組蛋白純化工藝的開發(fā)中。自從20世紀(jì)70年代中期融合標(biāo)簽技術(shù)出現(xiàn)以來，親和標(biāo)簽已成為一種重組蛋白純化十分有效的工具，含有結(jié)合特異性高、純化條件溫和、純化環(huán)節(jié)簡便、合用性廣泛等顯著優(yōu)勢。普通，親和標(biāo)簽定義為對特定的生物或化學(xué)配基含有高度親和力的一段氨基酸序列。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)出現(xiàn)了種類眾多、功效各異、用途多樣的親和標(biāo)簽，極大地增進(jìn)了對重組蛋白的有效純化。根據(jù)本身分子量大小的不同，親和標(biāo)簽?zāi)軌蚍譃閮纱箢悾阂活愂墙Y(jié)合固定化配基的短肽標(biāo)簽，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一類是識別小分子配基的蛋白標(biāo)簽，如GST、MBP等。短肽標(biāo)簽：His-tag：His標(biāo)簽是現(xiàn)在高通量蛋白純化最普遍使用的親和標(biāo)簽，廣泛用于多個重組蛋白在多個體現(xiàn)系統(tǒng)的體現(xiàn)與純化中。His標(biāo)簽普通為5~15個組氨酸，被認(rèn)為是重組蛋白純化的首選標(biāo)簽，含有下列優(yōu)點：（1）位于目的蛋白Ｎ端的His標(biāo)簽與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制互相兼容，利于蛋白的體現(xiàn)；（2）His標(biāo)簽幾乎不影響目的蛋白的理化性質(zhì)；（3）His標(biāo)簽很小，不會變化目的蛋白的可溶性；（4）His標(biāo)簽在目的蛋白結(jié)晶后對蛋白構(gòu)造幾乎沒有影響；（5）采用固定化金屬離子親和層析純化His標(biāo)簽融合蛋白時，其操作非常簡便?；谏鲜鰞?yōu)點，幾乎全部的大型構(gòu)造基因組研究中心都把純化His標(biāo)簽融合蛋白的固定化金屬離子親和層析（immobilizedmetal-ionaffinitychromatography，IMAC）作為重要的蛋白純化辦法。然而，并不是全部的蛋白質(zhì)都能夠與His標(biāo)簽融合后，采用固定化金屬離子親和層析分離純化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然發(fā)生的組氨酸豐富區(qū)域，在固定化金屬離子親和層析時可能會造成其它蛋白的非特異性結(jié)合；目的蛋白含有金屬離子，普通也不采用His標(biāo)簽與固定化金屬離子親和層析。FLAG-tag：除了His標(biāo)簽外，另一種廣泛使用的小分子短肽標(biāo)簽是FLAG標(biāo)簽。FLAG標(biāo)簽是由8個氨基酸（DYKDDDDK）構(gòu)成的一種短肽，分子量很小，因而不會遮蓋融合蛋白中其它的蛋白表位與構(gòu)造域，也不會變化融合蛋白的功效、分泌或運輸。該標(biāo)簽含有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于運用抗體檢測；同時含有一種腸激酶切割位點（DDDK），能夠運用腸激酶切除標(biāo)簽。FLAG標(biāo)簽有3個特異性的單克隆抗體，分別為M1單抗、M2單抗、M5單抗。FLAG短肽合成成本較高，不合用于大規(guī)模純化，且需要額外環(huán)節(jié)除去結(jié)合在層析介質(zhì)上的短肽。Strep-tagⅡ：與His-tag、FLAG-tag相似，Strep-tagⅡ也是一種小分子的短肽標(biāo)簽，廣泛用于多個目的蛋白在原核體現(xiàn)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞體現(xiàn)系統(tǒng)等的體現(xiàn)與純化中。在自然界中，鏈霉親和素（streptavidin）與生物素（biotin）之間存在著非常強(qiáng)烈的非共價互相作用，其生物學(xué)上的解離常數(shù)極低；即使生物素與其它蛋白質(zhì)共價結(jié)合之后，兩者仍能夠互相作用?；谶@兩者之間的強(qiáng)烈互相作用，運用一系列蛋白質(zhì)工程手段，通過對短肽文庫的篩選，第一種鏈霉親和素結(jié)合肽應(yīng)運而生，即Strep-tag，極大地方便了重組蛋白的一步快速親和純化。然而，Strep-tag與鏈霉親和素結(jié)合時需要一種自由的羧基末端，因而該標(biāo)簽只能位于目的蛋白的C端，限制了它的應(yīng)用范疇。在Strep-tag的基礎(chǔ)上，通過對合成短肽的篩選，獲得了一種與其相似、由８個氨基酸（WSHPQFEK）構(gòu)成的鏈霉親和素結(jié)合肽，即Strep-tagⅡ，能夠位于融合蛋白的任意位置，從而彌補(bǔ)了Strep-tag的局限性。同時，通過對鏈霉親和素特定氨基酸的定向突變，獲得了與Strep-tagⅡ含有更高親和力的親和介質(zhì)Strep-tactin，在Strep-tagⅡ融合蛋白的親和純化中體現(xiàn)出良好的純化效果，且蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，所需成本適中。Strep-tagⅡ系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin層析介質(zhì)結(jié)合，使用L的脫硫生物素就可將Strep-tagⅡ融合蛋白洗脫下來，螯合劑、去污劑、還原劑及高達(dá)1mol/L的鹽均可加入到緩沖液中。另外，Strep-tagⅡ在純化過程中不依賴金屬離子，十分適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化。蛋白標(biāo)簽：GST：GST標(biāo)簽由211個氨基酸構(gòu)成，大小約為26kDa，是現(xiàn)在廣泛用于重組蛋白融合體現(xiàn)與親和純化的一種蛋白標(biāo)簽。大量的體現(xiàn)實驗發(fā)現(xiàn)，外源蛋白在大腸桿菌體現(xiàn)系統(tǒng)中過量體現(xiàn)時，常會以包涵體的形式形成不溶性的聚合體，大大減少了可溶性重組蛋白的產(chǎn)量，增加了后續(xù)蛋白分離純化的難度。然而，在融合GST標(biāo)簽進(jìn)行原核體現(xiàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，原本用于親和純化的GST標(biāo)簽?zāi)茉谝欢ǔ潭壬显龃笕诤系鞍椎目扇苄?，使融合蛋白以可溶形式存在于?xì)胞質(zhì)中，不僅增進(jìn)了目的蛋白的對的折疊，提高了蛋白產(chǎn)量，并且有助于后續(xù)的蛋白純化。除了增大融合蛋白的可溶性之外，GST標(biāo)簽還含有高效的翻譯起始、純化條件溫和、親和樹脂成本相對低廉等顯著優(yōu)點，成為重組蛋白融合體現(xiàn)經(jīng)常使用的親和標(biāo)簽。MBP：MBP標(biāo)簽由大腸桿菌K12的malE基因編碼的396個氨基酸構(gòu)成，大小約為40kDa，是除了GST標(biāo)簽之外又一種較好的增大融合蛋白可溶性的蛋白標(biāo)簽。MBP標(biāo)簽?zāi)軌蛟龃笤谠梭w現(xiàn)系統(tǒng)中過量表達(dá)的融合蛋白的可溶性，提高其體現(xiàn)量，已在多個體現(xiàn)實驗中得到確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)變化MBP“開放”與“關(guān)閉”構(gòu)象之間的平衡時，MBP增大融合蛋白可溶性的能力將受到明顯影響，表明MBP增大融合蛋白可溶性的特性是由其“開放”構(gòu)象所介導(dǎo)；同時，對MBP配基結(jié)合間隙中保守的疏水性氨基酸殘基進(jìn)行定向突變，MBP體現(xiàn)出相似的表型，表明這個配基結(jié)合間隙在MBP增大融合蛋白可溶性的機(jī)制中含有一定的作用。然而，從蛋白純化的角度來看，MBP標(biāo)簽并不是一種最有效的親和標(biāo)簽；在某些狀況下，MBP標(biāo)簽并不能特異性地與親和樹脂有效結(jié)合，親和層析后融合蛋白的純度也并不適宜。自從上世紀(jì)70年代中期親和標(biāo)簽融合技術(shù)出現(xiàn)以來，多個多樣的短肽或蛋白親和標(biāo)簽極大地方便了外源體現(xiàn)重組蛋白的分離與蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化，已成為蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域不可或缺的工具。普通而言，一種完美的親和標(biāo)簽應(yīng)當(dāng)含有下列特性：（1）能夠用于純化任何體現(xiàn)宿主或體現(xiàn)系統(tǒng)所體現(xiàn)的重組蛋白；（2）能夠位于目的蛋白的任意位置而不影響其構(gòu)造；（3）增大目的蛋白的可溶性，增進(jìn)其對的折疊，提高蛋白體現(xiàn)量；（4）便于重組蛋白的檢測。現(xiàn)在，商品化的親和標(biāo)簽已含有其中諸多特性，但性能更加優(yōu)越、純化效果更加顯著的親和標(biāo)簽仍需不停尋找與開發(fā)。重組蛋白體現(xiàn)技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個具體領(lǐng)域。特別是體內(nèi)功效研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用重組蛋白體現(xiàn)載體。美國GeneCopoeia的蛋白體現(xiàn)載體按照體現(xiàn)宿主的不同新推出3類，分別為體現(xiàn)宿主為大腸桿菌，哺乳動物細(xì)胞的，以及慢病毒載體，宿主可覺得哺乳動物細(xì)胞和原代細(xì)胞。除了必要的復(fù)制和篩選的元件，協(xié)助體現(xiàn)和翻譯的元件外，本文將各類載體分別按照功效標(biāo)簽的不同擬定種類并將個標(biāo)簽的功效初步介紹以下：His6：His6是指六個組氨酸殘基構(gòu)成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一種標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成獨特的構(gòu)造特性（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進(jìn)行分離純化。使用His-tag有下面優(yōu)點：1.標(biāo)簽的分子量小，只有~，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，普通不影響目的蛋白的功效；標(biāo)簽融合蛋白能夠在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA互相作用研究；標(biāo)簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進(jìn)行免疫制備抗體；5.可應(yīng)用于多個體現(xiàn)系統(tǒng)，純化的條件溫和；6.能夠和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。Flag:Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核體現(xiàn)系統(tǒng)中體現(xiàn)效率更高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其融合體現(xiàn)目的蛋白后含有下列優(yōu)點：作為融合體現(xiàn)標(biāo)簽，其普通不會與目的蛋白互相作用并且普通不會影響目的蛋白的功效、性質(zhì)，這樣就有運用研究人員對融合蛋白進(jìn)行下游研究。2.融合FLAG的目的蛋白，能夠直接通過FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，能夠純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。作為標(biāo)簽蛋白，其能夠被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過WesternBlot、ELISA等辦法對含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測、鑒定。4.融合在N端的FLAG，其能夠被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白體現(xiàn)、純化、鑒定、功效研究及其蛋白互相作用等有關(guān)領(lǐng)域。MBP:MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過量體現(xiàn)的融合蛋白的溶解性，特別是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標(biāo)簽。如果蛋白在細(xì)菌中體現(xiàn)，MBP能夠融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范疇。某些融合蛋白在%TritonX-100或%Tween20存在下不能有效結(jié)合，而其它融合蛋白則不受影響。緩沖條件為到，鹽濃度可高達(dá)1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用MBP抗體或體現(xiàn)的目的蛋白特異性抗體檢測。GST:GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白本身是一種在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應(yīng)用在原核體現(xiàn)的因素大致有兩個，一種是由于它是一種高度可溶的蛋白，但愿能夠運用它增加外源蛋白的可溶性；另一種是它能夠在大腸桿菌中大量體現(xiàn)，起到提高體現(xiàn)量的作用。GST融合體現(xiàn)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于多個融合蛋白的體現(xiàn)，能夠在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中體現(xiàn)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)狀況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)狀況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。純化：該體現(xiàn)系統(tǒng)體現(xiàn)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中運用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保存了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用GST抗體或體現(xiàn)的目的蛋白特異性抗體檢測。HAHA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間構(gòu)造影響小,容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗體檢測和ELISA檢測。c-MycC-Myc標(biāo)簽蛋白，是一種含11個氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位體現(xiàn)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識別其對應(yīng)抗體。C-Myctag已成功應(yīng)用在Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計量術(shù)中,可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的體現(xiàn)。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分別是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,含有不同的激發(fā)波長發(fā)射波長為，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。就eGFP而言，相對于GFP，其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核體現(xiàn)系統(tǒng)中體現(xiàn)效率更高。mCherry是從DsRed演化來的性能最佳的一種單體紅色熒光蛋白，能夠和GFP系列熒光蛋白共用，實現(xiàn)多色標(biāo)記體內(nèi)、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目的蛋白功效互相沒有明顯影響。這些熒光標(biāo)簽蛋白，其融合體現(xiàn)目的蛋白后含有下列優(yōu)點：1.不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的體現(xiàn)狀況，并且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被譽(yù)為活細(xì)胞探針。2.其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細(xì)胞中的定位等狀況。3.同時細(xì)胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會干擾標(biāo)簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、敏捷度高并且重現(xiàn)性。4.其低消耗、高敏捷度檢測，十分合用于高通量的藥品篩選。因此現(xiàn)eGFP體現(xiàn)標(biāo)簽被廣泛地應(yīng)用于基團(tuán)體現(xiàn)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功效研究、蛋白在細(xì)胞中的功效定位、遷移變化及藥品篩選等方面。紅色熒光蛋白在標(biāo)記病毒顆粒，研究病毒和宿主細(xì)胞之間更有得天獨厚的優(yōu)勢。如用mRFP或mCherry標(biāo)記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細(xì)胞問的互相作用以及HIV侵染宿主細(xì)胞的過程．用mRFP標(biāo)記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制過程等。熒光素酶來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（LuciferaseAssay）。跟普通融合蛋白標(biāo)簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此慣用于研究啟動子、miRNA3'UTR克隆的功效與調(diào)控，由于它們對目的基因的調(diào)控能夠是漸變的，而不是簡樸的開和關(guān)兩種狀態(tài)。優(yōu)點：敏捷度高，檢測幅度寬；不是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性基因；重復(fù)性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報告并進(jìn)行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高敏捷的監(jiān)測辦法。并且螢火蟲和海腎熒光素酶是抱負(fù)的雙基因報告系統(tǒng)，由于它們來源于不同的生物進(jìn)化方向，蛋白構(gòu)造和底物差別都很大，在實驗中不會產(chǎn)生互相影響。基于熒光素酶的特性，我司研發(fā)提供的Secrete-PairDualLuminescenceAssayKit可用于分析雙報告系統(tǒng)中Gaussia熒光素酶（GLuc）和分泌型堿性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc和SEAP均為分泌型報告蛋白，無需裂解細(xì)胞即可便捷的從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得樣本，并對實驗成果進(jìn)行精確的實時分析。AviTagAviTag標(biāo)簽蛋白是一種15個氨基酸的短肽，含有一種單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，能夠加在目的蛋白的N端和C端。融合體現(xiàn)后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)互相作用研究。AviTag標(biāo)簽系統(tǒng)含有下列幾大優(yōu)點:1.無論在體外或者體內(nèi)，幾乎全部的蛋白都能夠在一種獨特的AviTag位點容易且有效地被生物素化；2.生物素化是通過酶和底物的反映來實現(xiàn)，反映條件相稱溫和并且標(biāo)記的專一性極高；3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間構(gòu)造的影響非常小。SNAP-TagSNAP-Tag是新一代的蛋白標(biāo)簽技術(shù)，不僅專一性極高并且穩(wěn)定，最大的優(yōu)點是合用于多個環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測與純化，如活細(xì)胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相(如SDSgels)等。SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結(jié)合，使蛋白標(biāo)記上生物素或熒光基團(tuán)（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其它蛋白會和這類物質(zhì)作用，因此SNAP標(biāo)簽反映是高特異的。檢測：生物素或多個顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲入進(jìn)入細(xì)胞，方便快捷地進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)SNAP-Tag