苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖的研究

苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖的研究

隨著生物藥物、天然藥物和保健品的深入研究，山羊的研究成果迅速發(fā)表。目前多糖含量的測(cè)定方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),廣泛應(yīng)用的是苯酚-硫酸比色法。該法具有簡單、快速、無需多糖純品和貴重儀器等優(yōu)點(diǎn),且對(duì)水溶性樣品和非水溶性樣品均可測(cè)定。1糠醛衍生物的測(cè)定苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量是由Dubois等提出的。其原理是:多糖或寡糖被濃硫酸在適當(dāng)高溫下水解,產(chǎn)生單糖,并迅速脫水成糠醛衍生物,該衍生物在強(qiáng)酸條件下與苯酚起顯色反應(yīng),生成橙黃色物質(zhì),在波長490nm處和一定濃度范圍內(nèi),其吸光度A值與糖濃度C呈線性關(guān)系,從而可用比色法測(cè)定其含量。2實(shí)驗(yàn)方法2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖約100.0mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.2試驗(yàn)溶液的制備將樣品進(jìn)行適當(dāng)處理(如真空干燥、回流提取等,根據(jù)各品種不同而有差異),取適量,按一定比例稀釋,配制供試品貯備液。2.3餾分的收集稱取苯酚100g,加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g,常壓蒸餾,收集(180±2)℃餾分。精密稱取該餾分約10.0g置于200mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中,即得苯酚溶液,將其置于冰箱中備用。2.4條件選擇2.4.1濃硫酸水浴加熱試驗(yàn)精密吸取供試品貯備液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各1.0mL于100mL量瓶中,用水稀釋至刻度,分別作為供試品溶液和對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液1.0mL于兩個(gè)具塞試管中,各加苯酚液1.0mL,并分別迅速滴加濃硫酸5.0mL。一份于水浴中煮沸15min,另一份于40℃水浴中恒溫30min。另取兩份對(duì)照品溶液1.0mL同上操作。取出,冷卻至室溫,15min后于490nm處測(cè)其A值,選取A較高的作為實(shí)驗(yàn)溫度。2.4.2濃硫酸加入量a與c的反應(yīng)分別吸取供試品液和對(duì)照品液1.0mL5份,各加入苯酚液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,加水至2.0mL,再各滴加濃硫酸5.0mL,40℃恒溫30min后,測(cè)其A值,從苯酚液加入量達(dá)到某一值開始,A值基本保持不變,說明苯酚液量達(dá)到該值以上時(shí),反應(yīng)都能完成。另取供試品液和對(duì)照品液0.6mL各5份,分別加苯酚液1.0mL,再分別滴加濃硫酸2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL,并均用水稀釋至8.0mL,根據(jù)A的穩(wěn)定性,計(jì)算硫酸的最佳加入體積。2.4.3濃硫酸溶液分別取供試品液和對(duì)照品溶液1.0mL4份,各加苯酚液1.0mL,濃硫酸5.0mL,于選定溫度分別恒溫10,20,30,40min。測(cè)得A值,加熱到一定時(shí)間以后,A值不再變化,說明加熱該時(shí)間即可使反應(yīng)完全。另測(cè)反應(yīng)完成后樣品在不同時(shí)間內(nèi)的A值,結(jié)果應(yīng)在1h以上穩(wěn)定。2.5最大波長的測(cè)定依據(jù)2.4確定的測(cè)定條件,精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)生物藥物溶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mL(相當(dāng)于葡萄糖0.0,100,200,300,400,500,600,700,800ug),分別置于10mL具塞刻度試管中,各加水使成1.0mL,然后分別加入苯酚溶液,搖勻,迅速加入濃硫酸,振搖5min后置相應(yīng)溫度水浴中加熱一定時(shí)間,取出置冷水中冷卻,最后加水至刻度,搖勻。用分光光度計(jì)在波長490nm處測(cè)定吸光度。以A值對(duì)濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=a·C+b(a、b根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定)。2.6復(fù)合多糖含量的測(cè)定將樣品多糖純品適量,按適當(dāng)比例稀釋,使單糖濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中C范圍內(nèi),作為純品貯備液。精密吸取該貯備液100ul,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作項(xiàng)下的方法測(cè)定A,求出樣品多糖的濃度C(ug/mL),按f=W/(C·D)計(jì)算換算因子。式中W(ug)為多糖含量;D為純品的稀釋倍數(shù)。若樣品多糖無純品,如可能進(jìn)一步純化,則將樣品進(jìn)行提純后用于測(cè)定校正因子。2.7多糖含量測(cè)定取樣品適量,精密稱定,稀釋,按照2.5中條件進(jìn)行測(cè)定,得到多糖濃度C,按多糖含量(%)=[(C·D·f)/W樣]×100%計(jì)算多糖含量。式中W樣為樣品重量;D為樣品的稀釋倍數(shù);f為換算因子。3討論3.1采用分光光度計(jì)測(cè)定糖的方法，操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線a值的保持備液用量,可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整,使A值保持在靈敏范圍內(nèi),保證樣品濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線C范圍內(nèi),以免測(cè)定結(jié)果偏離真實(shí)值,但各溶液的用量前后盡可能不要變化太大。3.3正交試驗(yàn)結(jié)果易程度不同,故水解的條件應(yīng)事先確定。水解不夠,單糖不能充分釋出;水解條件過度,釋出的單糖或有關(guān)糠醛衍生物會(huì)被部分破壞。測(cè)定條件選擇的三個(gè)影響因素,可進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)來確定最佳條件。測(cè)定條件選擇中各影響因素的不同水平可根據(jù)樣品自身?xiàng)l件進(jìn)行調(diào)整,如反應(yīng)溫度常有煮沸、40℃和室溫等,但室溫放置在不同氣候條件下影響因素不恒定,因此不多用。3.4多糖含量的測(cè)定即不能制得多糖純品,可不進(jìn)行校正因子測(cè)定。根據(jù)得到的多糖濃度C和W樣、D直接計(jì)算多糖含量(%)。3.5葡萄糖與其它單糖的顯色反應(yīng)雖一般大致相近,但有一定差異。故要求較高的測(cè)定中,應(yīng)加以校正。因其他單糖的顯色反應(yīng)有的比葡萄