樹(shù)狀多抗原肽的合成

樹(shù)狀多抗原肽的合成

由樹(shù)脂酸嚴(yán)格設(shè)計(jì)和控制分子的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。這些特點(diǎn)使其在模擬大生物分子的功能上有巨大的潛力,如可用作藥物載體或用作合成多肽疫苗的免疫原等。樹(shù)狀的多抗原肽不需與載體蛋白相連而能很好地誘導(dǎo)免疫反應(yīng),與直鏈多肽相比可更好地與特異性抗體相結(jié)合。在含有不同抗原肽的樹(shù)狀多抗原肽合成中,其中的一個(gè)關(guān)鍵步驟是合成正交保護(hù)的賴(lài)氨酸。利用賴(lài)氨酸的兩個(gè)氨基合成含有不同抗原肽的樹(shù)狀多抗原肽時(shí),必須將這兩個(gè)氨基正交保護(hù),在脫去一個(gè)氨基保護(hù)基時(shí),另一個(gè)氨基保護(hù)基不受影響,從而可接上兩個(gè)不同序列的肽段。此外,在環(huán)肽、分枝肽、糖肽的合成中,以及肽的片段縮合中,各種各樣的正交保護(hù)的賴(lài)氨酸也起著很重要的作用。由于樹(shù)狀、環(huán)狀、分枝多肽合成中所用的保護(hù)基需要在比較溫和的條件下脫去,我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了下列未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的正交保護(hù)的賴(lài)氨酸:Dde—Lys(Z)—OH,Dde—Lys(Aloc)—OH,Aloc—Lys(Z)—OH,Z—Lys(Aloc)—OH其中,Fmoc可以在20%哌啶/DMF中脫去,Z在催化氫解下脫去,Aloc在零價(jià)鈀和親核試劑存在條件下脫去,Dde在2%肼/DMF中脫去。同時(shí),為滿(mǎn)足合成需要還合成了:Fmoc—Lys(Aloc)—OH,Dde—Lys(Fmoc)—OH這些正交保護(hù)的賴(lài)氨酸將在雙抗原肽樹(shù)狀多肽的合成中得到應(yīng)用。正交保護(hù)賴(lài)氨酸的合成路線(xiàn)如下:1改性氨基酸銅絡(luò)合物首先利用賴(lài)氨酸α位的氨基和羧基與銅易形成絡(luò)合物,先選擇性地將ε位的氨基與?；噭㈱—Cl、Aloc—Cl和Fmoc—Cl反應(yīng)得到ε位的氨基分別被Z、Aloc和Fmoc保護(hù)的賴(lài)氨酸銅絡(luò)合物,但當(dāng)試圖用DdeOH保護(hù)賴(lài)氨酸的ε位氨基時(shí),由于DdeOH與銅的絡(luò)合能力更強(qiáng),而得到DdeOH的銅絡(luò)合物,不能得到目標(biāo)化合物。對(duì)于比較穩(wěn)定的ε位Z保護(hù)的賴(lài)氨酸銅絡(luò)合物,由于其在水中的溶解性差,將其在鹽酸中溶解后通入H2S,然后用氨水中和得到產(chǎn)物;對(duì)于ε位Aloc保護(hù)的賴(lài)氨酸銅絡(luò)合物,因其在水中的溶解性較好,在加熱條件下直接通入H2S,可以得到解離完全的產(chǎn)物;對(duì)于ε位Fmoc保護(hù)的賴(lài)氨酸銅絡(luò)合物,由于Fmoc對(duì)堿不穩(wěn)定,使用EDTA二鈉鹽解離絡(luò)合的銅,條件溫和,缺點(diǎn)是解離時(shí)間較長(zhǎng)方可達(dá)到完全。ε氨基保護(hù)的賴(lài)氨酸經(jīng)堿(NaOH或Na2CO3)將α位的氨基從其內(nèi)鹽解離出來(lái)后,與Z—Cl、Aloc—Cl和Fmoc—Cl反應(yīng),即可得到部分正交保護(hù)的賴(lài)氨酸,反應(yīng)后用有機(jī)溶劑萃取除去過(guò)量的Z—Cl、Aloc—Cl或Fmoc—Cl,酸化后再用有機(jī)溶劑萃取得到比較純凈的產(chǎn)物,可以避免柱層析分離。在用DdeOH保護(hù)ε氨基保護(hù)的賴(lài)氨酸的α位氨基時(shí),反應(yīng)需脫水,不利于在水中反應(yīng),但在有機(jī)溶劑中由于賴(lài)氨酸以?xún)?nèi)鹽形式存在,使其溶解性很差,故反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且不夠徹底。以DMF或乙醇作溶劑,DMF反應(yīng)程度和速度較乙醇好,但除去DMF比除去乙醇困難。以溶解能力較強(qiáng)的NMP(N-甲基吡咯烷酮)為溶劑進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)程度和速度均得到提高,但NMP的沸點(diǎn)很高,難以除去。綜合以上因素,我們認(rèn)為無(wú)水乙醇是較為理想的溶劑。2以碳醇為原料的aloc-cl和cy儀器:BRUKERINSTRUMBIFLEXⅢ質(zhì)譜儀,VARIANMERCURY200MHz核磁共振儀,Carlo-Erbla元素分析儀按文獻(xiàn)合成,Z—Cl和Aloc—Cl用芐醇和烯丙醇通入光氣得到。2.2-氨基酸和氨基酸的合成根據(jù)文獻(xiàn)可合成出H2N—Lys(Fmoc)—OH,H2N—Lys(Z)—OH,H2N—Lys(Aloc)—OH。2.3正交保護(hù)氨基酸合成2.3.1油混合物cde400mg(1.43mmol)H2N—Lys(Z)—OH和260mg(1.43mmol)DdeOH分別懸浮和溶解于10mLDMF中,回流30h,TLC檢測(cè)反應(yīng)終止,Rf=0.48(CHCl3:MeOH=7:2V/V),濃縮后柱層析分離(CHCl3:MeOH從20:1到6:1(V/V)梯度洗脫),得到油狀物300mg,產(chǎn)率45%。質(zhì)譜(C24H32O6N2):(MALDI-TOF)m/z,445(M+H)+,467(M+Na)+,489(M+2Na-H)+。1HNMR(200MHz,CDCl3)W:0.93(6H,s,DdeMe2),1.35(4H,m,CγH2CδH2),1.79(2H,m,CβH2),2.28(4H,s,Dde2CH2),2.40(3H,s,DdeC=CMe),3.41(2H,m,ε2),4.24(1,,α),5.01(2,,—2),5.56(1,,ε),7.27(5,),13.46(1H,brs,NαH氫鍵).元素分析(C24H32O6N2,444.53),實(shí)驗(yàn)值(%):C64.52,H6.95,N5.97;計(jì)算值(%):C64.85,H7.26,N6.30。2.3.2質(zhì)譜ms將0.8g(3.5mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH和0.63g(3.5mmol)DdeOH溶于15mL無(wú)水乙醇中,回流40h,TLC(CHCl3:MeOH=7:2V/V,Rf=0.41)測(cè)反應(yīng)終止,蒸除溶劑后,殘余物用CHCl3:MeOH從20:1到8:1(V/V)梯度洗脫柱層析分離,到淺黃色油狀物產(chǎn)率質(zhì)譜203062H)+,1HNMR(200MHz,CDCl3)δ:1.04(6H,s,Dde,Me2),1.52(4H,m,CγH2CδH2),1.96(2H,m,CβH2),2.40(4H,s,Dde2CH2),2.53(3H,s,DdeC=CMe),3.47(2H,m,CεH2),4.42(1H,m,CαH),4.54(2H,m,AlocCH2),5.24(2H,m,AlocCH2=),5.58(1H,brs,NεH),5.90(1H,m,AlocCH=),13.78(1H,brs,NαH氫鍵).元素分析(C20H30O6N2,394.47),實(shí)驗(yàn)值(%):C61.20,H7.70,N6.89;計(jì)算值(%):C60.90,H7.67,N7.10。2.3.3余物柱層析分離500mg(1.4mmol)H2N—Lys(Fmoc)—OH,246mg(1.4mmol)DdeOH溶于15mL無(wú)水乙醇中,回流35h,TLC檢測(cè)反應(yīng)終止,產(chǎn)物Rf=0.46(CHCl3:MeOH=7:2V/V),蒸除溶劑后,殘余物柱層析分離(CHCl3:MeOH從20:1到7:1(V/V)梯度洗得到淺黃色油狀物產(chǎn)率質(zhì)譜313662+555(M+Na),577(M+2Na-H);HNMR:(200MHz,CDCl3)W:0.91(6H,s,DdeMe2),1.33(4H,m,CγH2CδH2),1.80(2H,m,CβH2),2.24(4H,s,Dde2CH2),2.39(3H,s,DdeC=CMe),3.02ε22αεArH),8.02(1H,s,CαOOH),13.58(1H,brs,NαH氫鍵).元素分析(C31H36O6N2,532.64),實(shí)驗(yàn)值(%):C69.74,H7.15,N5.19,計(jì)算值(%):C69.91,H6.81,N5.26。2.3.4水相氧化酶的提取將400mg(1.43mmol)H2N—Lys(Z)—OH懸浮于6mLH2O中,冰鹽浴冷卻下,滴加0.36mL4mol/LNaOH,使固體溶解。然后加入烯丙氧羰氯0.5mL(516mg,4.29mmol)及15～20滴4mol/LNaOH,劇烈攪拌,反應(yīng)過(guò)程中始終保持酚酞顯紅色(pH9～10)。室溫反應(yīng)15min,用乙醚洗去過(guò)量的Aloc—Cl然后用濃鹽酸將水相酸化到pH為3～5。用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相用飽和NaCl溶液洗至中性。無(wú)水硫酸鈉干燥,旋去溶劑,得到無(wú)色油狀物410mg,f=0.45(3:=7.2/),產(chǎn)率79%,質(zhì)譜(C18H24O6N2):(-)/,387(M+Na)+。1HNMR(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH2CδH2),1.78(2H,m,CβH2),3.16(2H,m,CεH2),4.37(1H,m,CαH),4.55(2H,m,AlocCH2),5.08(2H,s,ZCH2),5.24(2H,m,AlocCH2=),5.65(1H,m,NαH),5.85(1H,m,AlocCH=),6.19(1H,m,NεH),7.34(5H,s,ArH),8.18(1H,s,CαOOH).元素分析(C18H24O6N2,364.40),實(shí)驗(yàn)值(%):C59.66,H6.68,N7.57;計(jì)算值(%):C59.33,H6.64,N7.69。2.3.5油物特性分析將1g(4.3mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH置于25mL三口瓶,2.5mL2mol/LNaOH,,2.5mL(7.5mmol)Z—Cl,2mol/LNaOH,以保持pH為9,加畢,反應(yīng)1h,注意維持pH在9左右。用乙醚洗兩次。水層滴6mol/LHCl到pH=1,用乙酸乙酯萃取。用5%NaCl水溶液洗至中性,無(wú)水硫酸鈉干燥,除去溶,得到油狀物0.9g,產(chǎn)率58%。Rf=0.56(CHCl3:MeOH=7:2)。質(zhì)譜(C18H24O6N2):(MALDI-TOF)m/z,387(M+Na)+,403(M+K)+,1HNMR(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH2CδH2),1.77(2H,m,CβH2),3.14(2H,m,CεH2),4.36(1H,m,CαH),4.54(2H,m,AlocCH2),5.10(2H,m,ZCH2),5.23(2H,m,AlocCH2=),5.85(1H,m,AlocCH=),6.28(1Hbrs,NαH),7.10(1H,brs,NεH),7.33(5H,s,ArH),9.81(1H,s,CαOOH).元素分析(C18H24O6N2,364.40),實(shí)驗(yàn)值(%):C59.60,H6.78,N7.61;計(jì)算值(%):C59.33,H6.64,N7.69。2.3.6飽和na2co3法0.7g(2mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH溶于6mL二氧六環(huán)和6mL水,加入424mg(4mmol)Na2CO3,攪拌溶解,滴加0.5g(2mmol)Fmoc—Cl的5mL二氧六環(huán)溶液?？刂频渭铀俣炔皇笷moc—Cl沉淀。在滴加時(shí)不斷滴入飽和Na2CO3以保持反應(yīng)液pH在9左右。滴加完畢,室溫?cái)嚢?h。用6mol/LHCl中和到pH為2,用乙酸乙酯提取,水洗,無(wú)水硫酸鈉干燥旋去溶劑得到油狀物重結(jié)晶后得到白色固體收率89℃(88～90℃).1HNMR:(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH