嫁接在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

嫁接在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

植物育種技術(shù)最早起源于中國戰(zhàn)國時(shí)期，已有2000多年的歷史。在漫長的歷史進(jìn)程中，植物育種技術(shù)不斷發(fā)展和完善?，F(xiàn)在，作為一種傳統(tǒng)的無性繁殖手段，種植技術(shù)在許多生產(chǎn)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如果樹、蔬菜、花卉等。它可以提高植物的抗逆性，提高質(zhì)量，提高產(chǎn)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大經(jīng)濟(jì)效益。生產(chǎn)意義上的嫁接是指有目的地將一株植物的芽或枝等器官接到另一株帶有根系的植株上的過程,上面的枝或芽稱為接穗(scion),下面帶根系的部分稱為砧木(stock).自體嫁接(autograft)的嫁接雙方來自同種的同一植株,同種嫁接(homograft)的嫁接雙方來自同種植物的不同植株,異種嫁接(heterograft)指不同種植株間的嫁接.生產(chǎn)上應(yīng)用的嫁接組合多是親和的,親和表現(xiàn)在嫁接后嫁接雙方可以成活、正常生長直至開花結(jié)果.這些組合是人們在長期生產(chǎn)實(shí)踐中精心選擇的結(jié)果.但多數(shù)嫁接組合是不親和性的,表現(xiàn)在嫁接后嫁接一方或雙方的死亡.嫁接作為一個(gè)特異的研究系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)運(yùn)輸、花期調(diào)節(jié)和信號的長距離傳導(dǎo)機(jī)制等方面的研究.本文擬就嫁接的方法、嫁接體的發(fā)育過程、嫁接在植物生命科學(xué)研究中的應(yīng)用作一綜述.1嫁接面的發(fā)育植物常用的嫁接部位為莖,可以采用平接、劈接、靠接等方法.最為常用的方法為劈接,劈接是將接穗下端切成楔形,將砧木平切后再切出劈口,將接穗的楔形下端插入砧木劈口進(jìn)行嫁接.在研究嫁接發(fā)育過程時(shí)常采用平接,即將接穗和砧木的嫁接面都切成平面,然后對接.靠接是將接穗和砧木各削去部分表皮和皮層,暴露出形成層,然后將切面進(jìn)行對接的嫁接.對于成功的嫁接來說,接穗和砧木在解剖結(jié)構(gòu)上的精密嵌接是十分重要的.維管系統(tǒng)和形成層的錯(cuò)位經(jīng)常導(dǎo)致嫁接的失敗或發(fā)育的延遲.隨著嫁接理論和實(shí)踐的發(fā)展,為了不同的研究目的,在傳統(tǒng)嫁接方法的基礎(chǔ)上,人們采用了各種其他嫁接方法,包括愈傷組織嫁接、離體莖段嫁接以及試管苗嫁接等.為了研究不親和嫁接的細(xì)胞反應(yīng),Moore和Walker將Sedumtelephoides和Solanumpennellii的愈傷組織在離體條件下嫁接,發(fā)現(xiàn)嫁接引起臨近嫁接面處細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨大和細(xì)胞壁的明顯加厚.將Pyruscommunis和Cydoniaoblonga的愈傷組織共同進(jìn)行懸浮培養(yǎng),導(dǎo)致Cydoniaoblonga生長量的顯著減少.Gebhardt和Goldbach將櫻桃莖尖組織培養(yǎng)獲得的具有莖尖的試管苗與具有根系的試管苗在無菌條件下進(jìn)行顯微嫁接,然后嫁接植株在試管中的液體培養(yǎng)基中生長.組織學(xué)檢查證實(shí),接穗和砧木間建立了維管組織連接.Russo和Slack采用土豆試管苗嫁接,建立了篩選和分析抗病毒土豆植株的方法.植物莖段離體嫁接的方法是由Parkinson和Yeoman提出的,將植物部分莖的切段嫁接在一起,然后無菌培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中.該方法模擬植物的正常生理狀況,將培養(yǎng)基分成兩部分.與接穗接觸的培養(yǎng)基中加入一定濃度的蔗糖、生長素和細(xì)胞分裂素,在與砧木相連的培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素.與常規(guī)的植物整體嫁接相比,該方法作為研究系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn):(1)沒有枝葉和根的影響,可以更精確地研究嫁接面的發(fā)育過程;(2)可以方便地改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件,以探討各種因素對嫁接成活的影響和作用,從而有助于了解親和性的本質(zhì).擬南芥(Arabidopsisthaliana)作為模式植物,已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)研究.擬南芥嫁接系統(tǒng)可用于研究物質(zhì)運(yùn)輸、信號傳導(dǎo)、成花誘導(dǎo)、系統(tǒng)抗性、非生物脅迫的應(yīng)答等許多方面.擬南芥葉基生,呈蓮座狀排列,合適的嫁接位點(diǎn)是花序軸和下胚軸部位.花序軸部位的嫁接可以采用劈接和平接的方法.平接的方法是在擬南芥抽苔后,用鋒利刀片平切花序軸,嫁接部位套上硅膠管(內(nèi)徑0.5mm,側(cè)面剖開),使接穗與砧木緊密接觸,嫁接初期需要采取措施,保持濕度,有利于嫁接面早期的發(fā)育.Turnbull等人首次建立了擬南芥下胚軸嫁接系統(tǒng),采用在培養(yǎng)皿中生長的擬南芥幼苗,在超凈臺(tái)的體視顯微鏡下,將幼苗從下胚軸部位(子葉稍靠下部位)切斷,然后進(jìn)行自體或同種嫁接.在花序軸抽苔期進(jìn)行嫁接,由于花序軸直徑相對較粗,嫁接操作方便.但擬南芥發(fā)育到該時(shí)期,一系列重要的生理事件都已完成.大部分細(xì)胞已經(jīng)沒有分化能力,在該時(shí)期嫁接,限制了嫁接系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用范圍.擬南芥下胚軸嫁接系統(tǒng)由于植株較小,嫁接難度相對增大,但成活率較高,嫁接體適用于研究根系和地上部的物質(zhì)和信息交換.不同的研究者應(yīng)根據(jù)不同的研究需要選擇合適的嫁接方法.雖然Rhee和Somerville對擬南芥花序軸的平接嫁接進(jìn)行了初步的組織學(xué)觀察,但至今仍缺乏擬南芥嫁接植株的詳盡發(fā)育過程.而確定嫁接體接穗和砧木間維管組織何時(shí)貫通,對于確定信號傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸通過何種途徑進(jìn)行是非常重要的.2新冠肺炎疫情時(shí)愈傷組織的形成在草本植物親和性嫁接組合中,嫁接體的發(fā)育過程大致相同,主要包括:(1)隔離層的形成及接穗與砧木間的初始黏連;(2)愈傷組織的形成;(3)連接砧木和接穗間維管束橋的重新連通等.2.1漢苯磺酸鈉的檢測嫁接過程中的切割導(dǎo)致隔離層(又稱壞死層,necroticlayer)的形成.電子顯微鏡觀察表明,隔離層由切割致死細(xì)胞的細(xì)胞壁殘留物構(gòu)成,其周圍分布著電子致密度高的物質(zhì).嫁接后1d,接穗和砧木發(fā)生初始黏連,嫁接面兩側(cè)細(xì)胞中高爾基體數(shù)目的增加及其分泌產(chǎn)物和嫁接雙方的初始黏連有關(guān).嫁接初期,隔離層分布在整個(gè)嫁接面上,后來,隨著愈傷組織的形成和分裂,隔離層首先在維管束區(qū)域被突破,然后逐漸擴(kuò)展,使接穗和砧木得以直接接觸.隔離層的消失主要是由于兩側(cè)愈傷組織分裂所形成的生長壓力和愈傷組織的吸收.2.2原生細(xì)胞間的核心聯(lián)系嫁接2~3d后,嫁接面受傷部位周圍的薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂,形成愈傷組織.愈傷組織可由形成層、韌皮部薄壁細(xì)胞、木質(zhì)部薄壁細(xì)胞、髓部細(xì)胞分裂而形成.在草本植物中,愈傷組織細(xì)胞首先在維管束和皮層處形成,在髓部只有少數(shù)細(xì)胞進(jìn)行分裂.嫁接雙方愈傷組織細(xì)胞的交錯(cuò)生長,可使接穗和砧木進(jìn)一步連接在一起.嫁接面處愈傷維管組織的分化也是在這些愈傷組織細(xì)胞中進(jìn)行的.隨著愈傷組織的形成,在隔離層變薄區(qū)域,接穗和砧木細(xì)胞間形成胞間連絲,這種胞間連絲是在不分裂的細(xì)胞壁上次生形成的,故稱為次生胞間連絲.Kollmann和Glockmann在蠶豆(Viciafaba)/向日葵(Helianthusannuus)嫁接組合中,利用蠶豆和向日葵細(xì)胞各自的超微結(jié)構(gòu)特征,準(zhǔn)確界定接穗和砧木接觸的細(xì)胞壁,證實(shí)了接穗和砧木細(xì)胞間次生的種間胞間連絲的存在.既有貫穿細(xì)胞壁的連續(xù)的次生胞間連絲,也有中止于細(xì)胞壁中部的半胞間連絲形態(tài).在Impatienswalleriana/Impatiensolivieri嫁接組合中發(fā)現(xiàn),在嫁接面維管組織區(qū)域,次生胞間連絲多為連續(xù)的胞間連絲,在皮層和髓部,接穗和砧木細(xì)胞間的次生胞間連絲中半胞間連絲的比例較高.次生胞間連絲的形成,將嫁接雙方的細(xì)胞連接成一個(gè)統(tǒng)一的共質(zhì)體,使鄰近細(xì)胞的物質(zhì)交流和細(xì)胞通訊得以實(shí)現(xiàn),可能對嫁接體的進(jìn)一步發(fā)育起著重要作用.Wang發(fā)現(xiàn),在Viciafaba/Helianthustuberosus不親和嫁接組合中,接穗和砧木之間沒有貫通的胞間連絲形成,嫁接雙方之間也沒有韌皮部的連通.2.3離體莖段嫁接的發(fā)育連接接穗和砧木維管束橋的形成是親和性嫁接發(fā)育的關(guān)鍵事件.在草本植物的嫁接組合中,嫁接后3d就可以在愈傷組織中觀察到管狀分子的分化,這些新分化的管狀分子形狀不規(guī)則,一般由嫁接面處的愈傷組織細(xì)胞或者維管束周圍的薄壁細(xì)胞直接分化而來.在分化前,這些細(xì)胞一般不進(jìn)行分裂.豌豆(PisumsativumL.)根自體嫁接后4d,接穗和砧木愈傷組織中分化出管狀分子,嫁接后7d,可觀察到連接接穗和砧木維管束的愈傷木質(zhì)部橋.在蠶豆和假酸漿(Nicandraphysaloides)的離體莖段自體嫁接中,嫁接后5d,也能觀察到愈傷木質(zhì)部橋的形成.Monzer和Kollmann依據(jù)2種植物導(dǎo)管分子壁加厚的形態(tài)不同,確定了Lophophorawilliamsii/Trichocereusspachianus嫁接組合中嫁接雙方愈傷導(dǎo)管分子的連接部位.嫁接面處的愈傷組織細(xì)胞和薄壁細(xì)胞在分化為篩分子前,往往要進(jìn)行一到幾次分裂,以形成篩分子和伴胞.豌豆根自體嫁接后4d,接穗和砧木愈傷組織中分化出篩分子,嫁接后8d,可觀察到連接接穗和砧木維管束的愈傷韌皮部橋.在Cucumissativus/Cucurbitaficifolia嫁接組合中,貫穿嫁接面的愈傷韌皮部橋在嫁接后7d內(nèi)建立,在Cucumissativus/Cucurbitaficifolia種間嫁接中,接穗和砧木之間的愈傷篩管數(shù)目顯著低于Cucumis或Cucurbita的自體嫁接.在離體莖段嫁接系統(tǒng)中,蠶豆或假酸漿自體嫁接后5d,假酸漿/番茄(Lycopersiconesculentum)種間嫁接后7d,可以觀察到連接接穗和砧木的愈傷韌皮部橋.在蠶豆和向日葵的嫁接中,使用細(xì)胞標(biāo)志,可以對接穗和砧木的篩分子加以區(qū)別.蠶豆的篩管中含有P型質(zhì)體,向日葵的篩管中則含有S型質(zhì)體.兩種篩管中,P蛋白的形態(tài)也有區(qū)別.依據(jù)這些細(xì)胞標(biāo)志,可以準(zhǔn)確地識別蠶豆和向日葵間的種間篩板.隨著愈傷木質(zhì)部和愈傷韌皮部的進(jìn)一步分化,在二者之間會(huì)分化出形成層,最終將接穗和砧木間原有的形成層連接起來.在草本植物中,形成層往往在嫁接2~3周后形成.嫁接面處形成層的分化十分重要,它可以分化形成更多的維管組織,以連通接穗和砧木,保證嫁接體雙方之間的物質(zhì)交換能夠暢通無阻地進(jìn)行.嫁接面處形成層的形成常作為嫁接面發(fā)育完成的標(biāo)志.對假酸漿和蠶豆兩個(gè)自體離體嫁接組合的研究表明,離體莖段嫁接的發(fā)育過程由下列步驟組成:(1)在接穗和砧木結(jié)合處形成隔離層;(2)隔離層兩側(cè)的薄壁細(xì)胞分裂形成愈傷組織;(3)在愈傷組織的特定區(qū)域中,分化產(chǎn)生管狀分子和篩分子,其相互連接,貫穿嫁接面,形成木質(zhì)部和韌皮部橋;(4)在嫁接面管狀分子和篩分子之間分化出形成層,其分裂產(chǎn)生更多的連接嫁接雙方的維管組織.由此可見,離體莖段嫁接體嫁接面的發(fā)育過程和整體嫁接基本一致.鑒于培養(yǎng)條件的一致性,該方法較整體嫁接更適用于生化和生理研究,從而為嫁接親和機(jī)制的研究開辟了一條新途徑.嫁接的成功與否受遺傳、結(jié)構(gòu)、生長特性和生理生化等因素的影響.遺傳因素是影響親和性的重要因素.一般來講,接穗與砧木分類學(xué)上關(guān)系越近,嫁接成功率越高,反之,排異現(xiàn)象越強(qiáng)烈.在不親和性的嫁接組合中,大部分接穗和砧木間沒有維管束橋的形成.有時(shí)雖然可以形成維管束橋,但篩管隨后被胼胝質(zhì)堵塞而喪失功能.生理因素可能是嫁接不親和的重要原因.Gur等人在研究Pyruscommunis/Cydoniaoblonga嫁接組合時(shí)發(fā)現(xiàn),在較高溫度下,Cydoniaoblonga中產(chǎn)生一種扁氰苷物質(zhì),而Pyruscommunis中產(chǎn)生一種uf062-扁氰苷酶.在嫁接面處,uf062-扁氰苷在uf062-扁氰苷酶的作用下,分解產(chǎn)生有毒的含氰物,最終導(dǎo)致嫁接體的死亡.3檢測育種方法及育種表面的發(fā)育過程和親和力3.1嫁接結(jié)合部抗張強(qiáng)度的變化Roberts和Brown提出,通過檢測嫁接結(jié)合部的抗張強(qiáng)度(tensilestrength)與嫁接后時(shí)間的關(guān)系,來研究嫁接面的發(fā)育過程和預(yù)測嫁接親和性.抗張強(qiáng)度以斷裂重量(breakingweight)表示,即在一測試儀器上,使接穗與砧木結(jié)合處斷裂所需施加的重量,即斷裂重量(g)/單位嫁接面面積(mm2).研究結(jié)果表明,在嫁接體形成過程中,嫁接結(jié)合部抗張強(qiáng)度的變化可分為3個(gè)階段.以親和的Sedumtelephioids自體嫁接和不親和的Sedumtelephioids/Solanumpennellii遠(yuǎn)緣嫁接為例:(1)嫁接初期1~3d,抗張強(qiáng)度的值及其增長速率較低,親和性組合與不親和性組合每天平均增重1g/mm2;(2)抗張強(qiáng)度持續(xù)升高,親和性自體嫁接的抗張強(qiáng)度在嫁接后3~11d持續(xù)增長,抗張強(qiáng)度增至前一時(shí)期的28倍,斷裂重量達(dá)56g/mm2.而非親和組合在持續(xù)2~5d后,嫁接面的抗張強(qiáng)度即達(dá)到最大值,斷裂重量為12g/mm2;(3)親和性組合的抗張強(qiáng)度趨于平穩(wěn),斷裂重量與未嫁接的節(jié)間相似;而非親和組合自第5天開始,抗張強(qiáng)度逐漸下降.抗張強(qiáng)度的變化與嫁接結(jié)合部的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)變化是相關(guān)的.因而,這個(gè)方法可以用來檢測嫁接體的形成過程和預(yù)測嫁接親和性.3.2親和性嫁接組合Yang等人測定了親和的番茄自體嫁接與不親和的嫁接組合莧菜(Amaranthustricolor)/番茄嫁接結(jié)合部的電阻值變化.獲得的結(jié)果表明,嫁接結(jié)合部電阻的變化與嫁接面的發(fā)育過程相關(guān).嫁接后2~3d,由于隔離層的形成和逐漸加厚,電阻值持續(xù)升高.在親和性嫁接組合中,嫁接后3~8d,隨著愈傷組織的產(chǎn)生、隔離層被突破和接穗與砧木細(xì)胞間次生胞間連絲的形成,嫁接結(jié)合部的電阻值逐漸下降.直至接穗和砧木間維管束橋形成后,電阻值趨于平穩(wěn),并恢復(fù)到嫁接前水平.在非親和性嫁接組合中,由于隔離層持續(xù)存在,接穗與砧木細(xì)胞間不形成次生胞間連絲,雙方維管束之間也沒有維管束橋形成,結(jié)合部電阻值不恢復(fù),呈現(xiàn)“居高不下”的現(xiàn)象.通過電阻值的檢測,可以了解嫁接體的形成過程和預(yù)測嫁接的親和性與非親和性.這個(gè)方法可在同一嫁接植株上連續(xù)測定,因此較斷裂法而言,其優(yōu)點(diǎn)是不損壞植株.3.3嫁接植株的發(fā)育根的水導(dǎo)性(hydraulicconductance,L0)反映了嫁接植株?duì)I養(yǎng)和水分的吸收狀態(tài),L0值的測定也可用于檢測嫁接植株的發(fā)育過程.Fernández-García等人測定了番茄嫁接植株在嫁接后4,8,12,15d的L0值.L0值在嫁接后4d的值為零,其后呈直線增加,在12~15d達(dá)到恒定值.使用組織學(xué)方法,嫁接后15d,在嫁接面處(graftunion)觀察到連接接穗和砧木的木質(zhì)部導(dǎo)管.L0值數(shù)值的變化體現(xiàn)了嫁接植株木質(zhì)部的發(fā)育過程.4在植物生命周期研究中，移植系統(tǒng)的應(yīng)用4.1同化物輸導(dǎo)連通砧木和接穗的維管束橋的形成是親和性嫁接組合發(fā)育的一個(gè)重要標(biāo)志.成功的嫁接組合不僅表現(xiàn)在結(jié)構(gòu)上,更重要的是,所產(chǎn)生的維管束橋能否執(zhí)行生理功能,進(jìn)行接穗和砧木間的物質(zhì)交換.這種物質(zhì)交流是雙向的,從接穗到砧木,或者從砧木到接穗.在嫁接研究中,常用同化物和礦物質(zhì)運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)嫁接面處維管組織的發(fā)育程度和輸導(dǎo)功能.Parkinson等人在離體莖段嫁接中,用不同直徑的氧化鐵粒子測定嫁接面處木質(zhì)部導(dǎo)管的輸導(dǎo)功能,發(fā)現(xiàn)在親和的番茄和假酸漿自體嫁接中,鐵粒子可以隨水分自砧木輸導(dǎo)到接穗,但在不親和的番茄/假酸漿組合中,在接穗中檢測不到鐵粒子,說明嫁接的不親和性和嫁接面處木質(zhì)部的輸導(dǎo)能力有關(guān).放射性同位素標(biāo)記的同化物常用于檢驗(yàn)嫁接雙方韌皮部的連通情況.DeStigter采用14C標(biāo)記的CO2,研究同化物在Silenearmeria自體嫁接中的輸導(dǎo),發(fā)現(xiàn)嫁接后7d起,同化物可以自嫁接體一方輸導(dǎo)入另一方,嫁接后16d達(dá)到最高輸導(dǎo)速率,在嫁接體中,同化物的輸導(dǎo)也是受庫源關(guān)系調(diào)節(jié)的.RachowBrandt和Kollmann在親和的番茄/馬鈴薯嫁接組合中發(fā)現(xiàn),在嫁接后前5d,嫁接雙方之間的韌皮部橋尚未建立,僅有少量的同化物自接穗經(jīng)薄壁細(xì)胞輸入砧木.14C標(biāo)記的同化物通過韌皮部自接穗向砧木的輸導(dǎo)在嫁接后5~7d開始,隨著連接接穗和砧木的愈傷篩管數(shù)目的增加,同化物輸導(dǎo)速率隨之增加,說明同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)由愈傷韌皮部進(jìn)行.輸導(dǎo)在嫁接后第9天達(dá)到高峰.由于薯塊作為庫的強(qiáng)烈作用,有超過80%的同化物自接穗輸入砧木,而在番茄自體嫁接中只有60%的同化物進(jìn)入砧木.在不完全親和的Viciafaba/Helianthusannuus嫁接組合中,盡管在接穗和砧木間建立了韌皮部橋,但同化物從接穗向砧木中輸導(dǎo)的量很少,在嫁接后11d僅有2%左右,而同期在蠶豆和向日葵自體嫁接中則分別達(dá)到40%和30%.該組合同化物的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率明顯低于其他組合.Kollmann和Glockmann發(fā)現(xiàn),大量胼胝質(zhì)堆積在蠶豆和向日葵種間篩板的篩孔中,篩孔變得狹窄,這可能在某種程度上與不親和性有關(guān).在不親和嫁接組合中,同化物自接穗向砧木的輸導(dǎo)往往受阻.Wang和Kollmann用14C標(biāo)記的蔗糖,測定不同離體莖段嫁接組合在不同發(fā)育時(shí)期的同化物輸導(dǎo)情況.在親和性嫁接組合嫁接后3d,只有很少量的標(biāo)記蔗糖從接穗運(yùn)到砧木,這可能是通過擴(kuò)散作用經(jīng)次生胞間連絲運(yùn)輸?shù)?嫁接后5~7d,由于韌皮部橋的形成,同化物運(yùn)輸速率明顯提高.在不親和嫁接組合中,由于接穗和砧木間沒有愈傷韌皮部橋形成,所以同化物輸導(dǎo)速率一直很低,大部分被阻擋在嫁接面處.6(5)CF(carboxyfluorescein)是一種常用的篩管輸導(dǎo)的示蹤劑,其輸導(dǎo)途徑和同化物一樣是從源到庫.在熒光顯微鏡下,6(5)CF發(fā)黃綠色熒光,容易檢測.Sch?ning和Kollmann采用CF輸導(dǎo)方法,探討了番茄和向日葵自體離體莖段嫁接愈傷韌皮部的輸導(dǎo)功能.CF輸導(dǎo)結(jié)果證明,CF的輸導(dǎo)在愈傷韌皮部中進(jìn)行.Tiedemann和Carstens-Behrens采集Cucumissativus(接穗)/Cucurbitaficifolia或Cucurbitamaxima(砧木)嫁接后5~7周的篩管液,應(yīng)用SDS電泳方法檢查篩管液的蛋白質(zhì)帶型,同其自體嫁接篩管液(對照)的帶型相比較,發(fā)現(xiàn)自Cucumis接穗中采集的篩管液中至少有4條蛋白質(zhì)條帶是對照中沒有的,從其分子量上看,應(yīng)屬于Cucurbita篩管蛋白類型,包括CucurbitaPP1和PP2蛋白的亞單位.Golecki等人進(jìn)一步的研究表明,Cucumissativus作為接穗,嫁接到Cucurbita砧木9~11d后,至少9種篩管蛋白自砧木進(jìn)入接穗,說明嫁接后,嫁接面處的韌皮部重建后,接穗和砧木篩管內(nèi)的蛋白質(zhì)可以交流.在Cucumissativus接穗中檢測不到Cucurbita砧木PP1和PP2蛋白的mRNA,說明轉(zhuǎn)運(yùn)以蛋白狀態(tài)進(jìn)行.進(jìn)入Cucumissativus接穗的CucurbitamaximaPP1蛋白定位于外韌皮部的篩分子和伴胞中.4.2mirn3d突變體的基因表達(dá)利用突變體、轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株互為接穗和砧木進(jìn)行嫁接,可以有目的地分析某個(gè)特定信號的雙向長距離傳遞和作用規(guī)律.嫁接系統(tǒng)是研究植物體內(nèi)長距離信號傳遞的理想方法之一.(ⅰ)RNA通過韌皮部在植物體中的長距離轉(zhuǎn)運(yùn).近年來的研究發(fā)現(xiàn),某些RNA分子作為非細(xì)胞自生(non-cell-autonomous)的信號分子,進(jìn)行胞間或長距離的轉(zhuǎn)運(yùn)控制相關(guān)器官的發(fā)育或參與防御反應(yīng).植物的胞間連絲提供了蛋白質(zhì)或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)通道,而維管系統(tǒng)特別是特化的韌皮部,是非細(xì)胞自生蛋白質(zhì)和RNA-蛋白復(fù)合體的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)路徑.Xoconostle-Cázares等人將Cucumissativus嫁接到Cucurbitamaxima上,采集接穗中的篩管液,分析其分子組成,為砧木中CmPP16mRNA可以通過嫁接面轉(zhuǎn)運(yùn)至接穗提供了直接證據(jù).RuizMedrano等人利用另一個(gè)經(jīng)典的異種嫁接組合西葫蘆(Cucurbitamaxima)/黃瓜作為研究系統(tǒng),使用原位RT-PCR分析技術(shù),發(fā)現(xiàn)CmNACPmRNA等多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(transcrips)自西葫蘆砧木經(jīng)由韌皮部進(jìn)入黃瓜接穗的分生組織.CmNACP屬于NAC基因家族,此家族的一些成員參與頂端分生組織的發(fā)育.該實(shí)驗(yàn)證實(shí),植物體中的特定mRNA向莖頂端轉(zhuǎn)運(yùn).Kim等人研究了番茄鼠耳(mouseears,Me)突變體,該突變體是染色體重排導(dǎo)致的LeT6與PEP的融合.PEP-LeT6融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的過表達(dá)導(dǎo)致番茄葉表型的改變.將正常葉形的莖上端作為接穗嫁接到Me突變體砧木上,在接穗上新生的葉發(fā)育成鼠耳表型.通過原位PCR技術(shù)在接穗莖頂端檢測到Me的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.該發(fā)現(xiàn)證實(shí),在植物體內(nèi)起調(diào)控作用的mRNAs(regulatorymRNAs)可以通過長距離運(yùn)輸控制植物的形態(tài).馬鈴薯(Solanumtuberosumsubsp.Andigena)的BEL1-like轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactors)StBEL5通過作用于控制生長的靶基因,參與馬鈴薯塊莖的形成.嫁接實(shí)驗(yàn)表明,StBEL5的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在于韌皮部細(xì)胞中,能通過嫁接面運(yùn)輸至薯塊形成的部位——匍匐莖的頂端.上述研究表明,特定的mRNA分子可以通過韌皮部在植物體內(nèi)長距離運(yùn)輸,選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)至特定器官,調(diào)控植物的生長和發(fā)育.近年來發(fā)現(xiàn),小分子RNA(smallregulatoryRNAs)參與基因調(diào)控體系,在植物中可以分為MicroRNAs(miRNAs)和由21~24個(gè)核苷酸長度的(siRNA)兩類,在功能方面參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控.Pant等人發(fā)現(xiàn),將過表達(dá)miR399的植株作為接穗嫁接到野生型的砧木上,miR399可以自莖端移動(dòng)到根部.光受體phytochromeB(PHYB)和BEL5蛋白參與馬鈴薯塊莖形成時(shí)的光誘導(dǎo).miR172參與這個(gè)發(fā)育過程.在塊莖形成的短日照誘導(dǎo)條件下,馬鈴薯體內(nèi)miR172水平高于長日照誘導(dǎo)植株,促進(jìn)匍匐莖上塊莖的形成.將35S::miR172接穗嫁接到野生型砧木(35S::miR172/WT),塊莖的形成時(shí)間與35S::miR172/35S::miR172對照一樣,均較早,說明miR172對塊莖形成的促進(jìn)作用可以通過嫁接進(jìn)行傳遞.反之,以野生型為接穗、35S::miR172為砧木的嫁接(WT/35S::miR172)中,其表型類似于WT/WT嫁接對照,揭示miR172在嫁接體砧木部分的超表達(dá)對塊莖形成的促進(jìn)作用不顯著.miRNAs除了參與植物體內(nèi)大量的生理過程外,研究發(fā)現(xiàn),生物和非生物逆境條件引起大量miRNAs的表達(dá).例如,擬南芥在磷缺乏的情況下,誘導(dǎo)miR156,miR399,miR778,miR827和miR2111的表達(dá).擬南芥在硫飽和的情況下,miR395在韌皮部內(nèi)積累.在hen1-1突變體中,sRNA的甲基化(methylation)被阻礙,導(dǎo)致幾種miRNAs的水平顯著減少.Buhtz等人將野生型擬南芥作為接穗與hen1-1突變體進(jìn)行嫁接,讓嫁接體生長在硫飽和條件下,發(fā)現(xiàn)miR395自野生型接穗通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至hen1-1砧木.以hen1-1作為接穗、野生型作為砧木,則未能觀察到miR395自砧木輸入接穗.嫁接實(shí)驗(yàn)表明,miR395的轉(zhuǎn)運(yùn)是有方向性的,其轉(zhuǎn)運(yùn)方向?yàn)閺那o端至根部.miR171只能在嫁接體野生型部位檢測到,在嫁接體突變體部位則檢測不到,說明其不能通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn).(ⅱ)信號蛋白在植物體中的長距離轉(zhuǎn)運(yùn).高等植物遭受昆蟲攻擊或食草