四逆湯類方提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

四逆湯類方提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

“四逆湯方”是以醫(yī)學(xué)圣人張仲景為核心的“四逆湯”。用于治療少陰病、陽(yáng)虛、寒陰盛、真陰受損等疾病。其組方精良,配伍嚴(yán)謹(jǐn),蘊(yùn)涵豐富的配伍規(guī)律和以辨證為核心指導(dǎo)遣藥組方的配伍原則。包括四逆湯、通脈四逆湯、人參四逆湯、茯苓四逆湯、白通湯等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)配伍研究主要集中于“四逆湯”,目前尚未見(jiàn)“四逆湯類方”配伍規(guī)律研究的報(bào)道。本研究以“四逆湯”為核心,探討附子、干姜分別與蔥白、甘草、膽汁、人參配伍后的提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能影響的共性和個(gè)性,分析配伍使用的內(nèi)在規(guī)律。1材料和方法1.1小球糖提取物原料藥的鑒定及四逆湯類方提取物樣品由吉林省中醫(yī)中藥研究院徐東銘研究員完成。附子配干姜(干姜5、生附子10,EAG),白通湯(生附子9、干姜3、蔥白4,EAGO),白通加豬膽汁湯(生附子9、干姜3、蔥白4、豬膽汁3,EAGB),人參四逆湯(生附子10、干姜4.5、甘草6、人參3,EAGG),四逆湯(生附子10、干姜5、甘草6,EAGL)。以上配方經(jīng)水煎濃縮至浸膏,經(jīng)乙醚提取得提取物。得率為EAG(413g生藥/g)、EAGO(7275g生藥/g)、EAGB(961g生藥/g)、EAGL(337g生藥/g)、EAGG(792g生藥/g)。RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,USA);胰蛋白酶(Gibco,USA);96孔培養(yǎng)板(Costar,USA);四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma,USA);大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS,E.ColiO111∶B4,Sigma,USA);刀豆蛋白A(ConA,Sigma,USA);胎牛血清(FCS,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所,批號(hào)200204);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)AR。1.2動(dòng)物生產(chǎn)許可證昆明種小鼠,7～8周齡,體重20～25g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK[遼]2002-0002,附動(dòng)物質(zhì)量合格證)。L929細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心。1.3自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)倒置顯微鏡(OLYMPUS-CK40,Japan);自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)(CliniBio128C,EC);CO2培養(yǎng)箱(SANYOMCO-175M,Japan)。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)取數(shù)只小鼠,腹腔內(nèi)注射無(wú)血清培養(yǎng)液1.5mL,10min后頸椎脫臼處死小鼠,75%酒精浸泡消毒,無(wú)菌收集腹腔液。1000r/min離心10min收集細(xì)胞,用含10%FCS的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106/mL。以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,置培養(yǎng)箱中,經(jīng)5%CO2、37℃培養(yǎng)2h。棄上清液,用培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞,培養(yǎng)孔內(nèi)為腹腔巨噬細(xì)胞。每孔加培養(yǎng)液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)。1.4.2ank’s液制備取數(shù)只小鼠,頸椎脫臼處死,75%酒精浸泡消毒,無(wú)菌取材。胸腺組織置培養(yǎng)皿中,加少量Hank’s液,用無(wú)菌注射器芯擠壓后,制備成細(xì)胞懸液,過(guò)200目尼龍篩網(wǎng)。懸液經(jīng)1000r/min離心10min,棄上清。用含10%FBS的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106/mL,以每孔100μL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,置含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃孵育。1.4.3添加終濃度對(duì)eaga、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、eag、ea實(shí)驗(yàn)分7組,對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液,模型組加入LPS10μg/mL。依據(jù)文獻(xiàn),加藥組分別加入終濃度為25.0、5.0、1.0μg/mL的EAGO、EAGL、EAGB、EAGG和EAG,同時(shí)加入LPS10μg/mL,4個(gè)孔為一個(gè)平行樣本。5%CO2、37℃孵育24h,取培養(yǎng)液作為備用實(shí)驗(yàn)樣品上清。依次做以下實(shí)驗(yàn)。1.4.4測(cè)定活性化合物a值分組加藥的巨噬細(xì)胞經(jīng)37℃孵育24h后,在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入10μLMTT繼續(xù)培養(yǎng)。4h后中止反應(yīng),棄培養(yǎng)液,加入100μL二甲基亞砜。經(jīng)微量震蕩器處理后,用自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)定570nm處各孔的A值。以A值表示腹腔巨噬細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。1.4.5細(xì)胞活性測(cè)定分組加藥的巨噬細(xì)胞經(jīng)37℃孵育24h后,取培養(yǎng)液上清備用。每孔加入中性紅生理鹽水液,終濃度為1g/L,繼續(xù)培養(yǎng)20min。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3遍,每孔加入細(xì)胞溶解液(乙酸∶無(wú)水乙醇=50∶50)100μL,室溫放置2h。待細(xì)胞溶解后,用自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)各孔吸光度A值,測(cè)量波長(zhǎng)540nm。以A值表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱。1.4.6細(xì)胞培養(yǎng)和mtt活性將L929細(xì)胞懸液調(diào)整至2×105/mL,以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,37℃培養(yǎng)2h。取備用的各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清,以100μL/孔加入L929細(xì)胞培養(yǎng)板中,4個(gè)孔為一個(gè)平行樣本。飽和濕度條件下,37℃、5%CO2孵育48h。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入10μLMTT繼續(xù)培養(yǎng)。終止反應(yīng),棄培養(yǎng)液,加入100μL二甲基亞砜。經(jīng)微量震蕩器混合后,用自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)定570nm處各孔的A值。1.4.7mtt法培養(yǎng)細(xì)胞取培養(yǎng)的胸腺淋巴細(xì)胞,每孔加入終濃度為2μg/mL的ConA,對(duì)照組不加ConA。按實(shí)驗(yàn)分組分別加入備用巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清100μL,4個(gè)孔為一個(gè)平行樣本。飽和濕度,37℃、5%CO2孵育48h。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入10μLMTT繼續(xù)培養(yǎng)。終止反應(yīng),培養(yǎng)板離心后棄培養(yǎng)液,加入100μL二甲基亞砜。經(jīng)微量震蕩器混合后,用自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)定570nm處各孔的A值。1.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSSV10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行“t”顯著性檢驗(yàn)及方差分析。2結(jié)果2.1對(duì)臟器的咀嚼功能的影響腹腔巨噬細(xì)胞在LPS作用后,吞噬中性紅的功能下降,模型組與對(duì)照組比較差異顯著。與模型組比較,EAG、EAGO、EAGL、EAGB、EAGG組對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能均有顯著的促進(jìn)作用。除EAGG低劑量組外,各組與EAG組比較均無(wú)顯著差異(結(jié)果見(jiàn)表1)。2.2各組細(xì)胞增殖抑制作用的比較在LPS作用后,巨噬細(xì)胞上清液對(duì)L929細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,模型組與對(duì)照組比較差異顯著。與模型組比較,EAGO、EAGL組上清液對(duì)L929細(xì)胞的增殖抑制作用顯著降低,其他組作用不顯著。EAGO的中劑量組上清液對(duì)抑制L929細(xì)胞增殖的作用顯著高于EAG組(結(jié)果見(jiàn)表1)。2.3各組大鼠胸徑免疫指標(biāo)的激作用LPS作用后,巨噬細(xì)胞上清液對(duì)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞增殖有顯著刺激作用,模型組與對(duì)照組比較差異顯著。與模型組比較,EAG、EAGO及EAGB高劑量組刺激胸腺淋巴細(xì)胞的增殖。而EAGL、EAGG則顯著抑制其增殖,且強(qiáng)于EAG組。(結(jié)果見(jiàn)表1)。2.4模型組和對(duì)照組的比較LPS作用后,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的代謝活性增強(qiáng),模型組與對(duì)照組比較差異顯著。各加藥組對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的代謝活性均有顯著的增強(qiáng)作用,其中EAGG組的作用顯著強(qiáng)于EAG組(結(jié)果見(jiàn)表1)。3內(nèi)毒素作及其應(yīng)用四逆湯類方均可視為四逆湯之加減方,可用于各種慢性病惡化加重發(fā)展到衰竭階段,亦可用于多種急性病病情發(fā)展迅速,正不敵邪的危重狀態(tài)。迄今,尚未見(jiàn)四逆湯類方現(xiàn)代醫(yī)學(xué)比較研究的報(bào)道。從以往中醫(yī)臨床研究資料來(lái)看,類方之間的用藥依據(jù)病癥有所側(cè)重,似乎多用于和心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病,這些疾病與血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。從藥理作用的角度分析,類方之間的免疫調(diào)節(jié)作用顯然既有共性也各有特點(diǎn)。內(nèi)毒素是先天性免疫最強(qiáng)的刺激劑,參與單核-巨噬細(xì)胞的激活、細(xì)胞毒作用的發(fā)揮及炎性介質(zhì)的釋放。炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放可能導(dǎo)致廣泛的損傷等。內(nèi)毒素可刺激巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α,成為激活細(xì)胞因子的主要介質(zhì)。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)內(nèi)毒素作用后巨噬細(xì)胞TNF的生成量增加,上清液抑制了L929細(xì)胞的增殖。與模型組比較,附子、干姜分別與蔥白或甘草配伍組的培養(yǎng)液上清對(duì)L929細(xì)胞增殖的抑制作用下降,且附子、干姜配蔥白組的作用強(qiáng)于附子配干姜組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在內(nèi)毒素作用下,附子、干姜分別與蔥白或甘草配伍抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)TNF釋放的作用較強(qiáng),而其它配伍則作用不顯著,這與整體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)具有多種功能的免疫細(xì)胞,參與機(jī)體非特異性免疫反應(yīng),具有很強(qiáng)的吞噬功能。本實(shí)驗(yàn)中,加入內(nèi)毒素后腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的功能下降。而MTT測(cè)定的結(jié)果則表明,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性增強(qiáng),提示細(xì)胞的代謝活性增強(qiáng)。與模型組比較,各加藥組對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和代謝活性均有顯著的促進(jìn)作用。而且,附子、干姜與人參配伍其作用強(qiáng)于附子加干姜。IL-1是由內(nèi)毒素刺激單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的體內(nèi)作用最強(qiáng)的致炎介質(zhì)之一,可以誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子表達(dá)、誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子的釋放、引起血管擴(kuò)張等作用。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)內(nèi)毒素作用后巨噬細(xì)胞釋放IL-1增加,上清液刺激了胸腺淋巴細(xì)胞的增殖。與模型組比較,附子、干姜分別與甘草或人參配伍的上清液顯著抑制胸腺淋巴細(xì)胞的增殖,而其他加藥組的高劑量則刺激胸腺淋巴細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在內(nèi)毒素作用下,附子、干姜分別與甘草或人參配伍可以抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)IL-1的釋放量,而與蔥白或膽汁配伍則對(duì)IL-1的釋放量沒(méi)有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,