生物化學(xué)課件：第四章 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

第四章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

及分離分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、兩性性質(zhì)及等電點二、膠體性質(zhì)三、變性與復(fù)性作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、沉降作用六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點（pI）。溶液pH＝pI時，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；

pH＞pI時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；

pH＜pI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。等離子點：蛋白質(zhì)在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來決定，這種條件下的等電點稱為等離子點。等離子點是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。

等電點時特點：（1）凈電荷為零（2）一定離子強度的緩沖液（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點偏酸

堿性AA/酸性AA比例

等電點胃蛋白酶0.21.0

血紅蛋白1.76.7

細(xì)胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）在等電點時蛋白質(zhì)的導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。等電沉淀和蛋白電泳：

遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）

。電泳（

electrophoresis）蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質(zhì)和多核苷酸）瓊脂糖凝膠（核酸）單體：丙烯酰胺（Acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺(N,N'-Methylenebisacrylamide)增速劑：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小分子篩效應(yīng)電泳儀水平電泳槽垂直電泳槽聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)：濃縮膠和分離膠電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。+凝膠加樣濃縮膠分離膠巰基乙醇：打開二硫鍵。SDS：變性劑，破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。SDS以其氫鍵與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。①帶有很多負(fù)電荷——遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有電荷②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象：近似雪茄煙形的長橢圓棒，短軸長度相同，長軸長度隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比例變化。遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）遷移率等電聚焦電泳高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場的作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開。等電聚焦電泳電泳時，每種蛋白遷移至與它的pI相一致的pH處加入蛋白樣品電場作用下在凝膠中建立穩(wěn)定的一個pH梯度（等）電聚焦（IEF）：等電聚焦電泳+SDS-PAGE第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點；再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.雙向電泳pI降低分子量減小兩性電解質(zhì)溶液等電聚焦電泳SDS-PAGE二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)水化膜：通過氫鍵與水結(jié)合表面電荷：在非等電點狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團帶電荷，與極性水分子中的異性電荷吸引形成雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠作用：蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻,使它們以一定的部位結(jié)合形成長鏈。這些長鏈又彼此結(jié)合成為復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體。3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤作用：分類：（1）可逆性凝膠（2）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點4.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用滲析（透析）超濾透析（dialysis）三、蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性與凝固作用

在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（肽鍵不斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。（denaturationofprotein）1、變性理論

蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。2、引起蛋白質(zhì)變性的因素：①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機械攪拌②化學(xué)因素：強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。變性的因素及作用機制①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，結(jié)晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：官能團反應(yīng)性增加，呈色反應(yīng)增強，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。

變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變蛋白質(zhì)變性的可逆性－復(fù)性：某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)原來部分理化特性和生物學(xué)活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性

蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復(fù)性；如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu),并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性。核糖核酸酶的變性與復(fù)性去除變性劑并緩慢氧化天然構(gòu)象尿素，

-巰基乙醇變性狀態(tài)蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用蛋白質(zhì)的凝固作用天然蛋白質(zhì)變性后，變性蛋白質(zhì)分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation）。凝固作用分兩個階段：首先是變性；其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結(jié)絮;蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用

理論上：研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能,分子量測定,亞單位拆分；

生產(chǎn)生活中有利的一面：食品加工，消毒滅菌等；非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)；

生產(chǎn)生活中不利的一面：活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀（precipitation）。（precipitationofprotein）變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法

鹽析法

有機溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑和某些酸類沉淀法

加熱變性沉淀法

鹽析法

鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后，復(fù)可溶解。有機溶劑沉淀法

向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時間則可使變性速度減慢。重金屬鹽沉淀法

當(dāng)溶液pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽，然后再服用催吐劑排出體外。重金屬鹽常能使蛋白質(zhì)變性，這可能是因為重金屬鹽水解生成酸或堿的緣故。生物堿試劑和某些酸類沉淀法

生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如驟酸也稱單寧酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當(dāng)溶液pH小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗部門用來除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)。加熱變性沉淀法

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質(zhì)處于等電點也破壞了帶電狀態(tài)。我國很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點入少量鹽鹵（含MgCl2)的制豆腐的方法，這是成功的應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)的一個例子。1、沉降概念：蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時，由于比重關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，離心管底部的蛋白質(zhì)濃度增高。2、沉降速率：在離心時，蛋白質(zhì)分子在單位時間t（以秒計）內(nèi)下沉的距離x（以cm計）。以v表示。

v=dx/dt五、蛋白質(zhì)的沉降作用沉降作用3、沉降常數(shù)（沉降系數(shù)，S）

單位引力場沉降分子下沉的速率。

S=v/ω2xv：沉降速率（dx/dt）可以從實驗測得。ω：離心機轉(zhuǎn)子每秒鐘的角速度，以弧度/秒計。（即2Л×轉(zhuǎn)子每秒鐘的轉(zhuǎn)速）

x：蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心之間的距離（以cm計）。Svedberg單位的定義：單位引力場沉降分子下沉的速率。取1×10-13秒為一個Svedberg單位。例：①牛血清清蛋白的沉降常數(shù)為:4.4×10-13用Svedberg單位則為:4.4S②原核細(xì)胞核糖體的沉降常數(shù)為:70×10-13用Svedberg單位則為:70S六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)3.考馬斯亮藍(lán)G2504.福林酚試劑反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)8.坂口反應(yīng)—精氨酸特有的反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)

兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復(fù)合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng)肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍(lán)紫受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)

靈敏度差。3.考馬斯亮藍(lán)G-250本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強，靈敏度高11000微克/毫升六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)4.福林酚試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不