雞j亞群禽白血病病毒的分離鑒定

雞j亞群禽白血病病毒的分離鑒定

病毒性血清素（alv）是雞群中常見的反轉(zhuǎn)病毒。它會(huì)導(dǎo)致1.2%的成年雞引起內(nèi)臟腫瘤和死亡，偶爾也會(huì)達(dá)到20%。雞的經(jīng)典白血病主要是由外源性的A和B亞群病毒引起,少數(shù)由C和D亞群引起。通常,ALV引起的腫瘤都發(fā)生在14周齡以后,主要是在24～40周齡的雞。對(duì)該病毒的研究已有一個(gè)世紀(jì),對(duì)其中的一個(gè)成員Rous肉瘤病毒(RSV)的深入研究就導(dǎo)致了數(shù)項(xiàng)在生物學(xué)研究上具有里程碑作用的諾貝爾獎(jiǎng)。如發(fā)現(xiàn)并證明病毒可引起腫瘤,反轉(zhuǎn)錄酶和cDNA的發(fā)現(xiàn),原癌基因的發(fā)現(xiàn)等。利用剔除ALV感染種雞以切斷垂直傳播的方法,經(jīng)過多年的努力,到80年代中期,在世界各發(fā)達(dá)國(guó)家的商品雞群中已基本上消滅了這類經(jīng)典的外源性ALV的感染,雞群中只有無(wú)致瘤性的E亞群的內(nèi)源性ALV感染。然而在1988年,英國(guó)從肉用型雞群中分離出一株新的禽白血病病毒。根據(jù)病毒干擾和血清中和試驗(yàn)分析以及感染宿主譜等特點(diǎn),確定了該病毒是一類不同于已知的A-E亞群的禽白血病病毒,稱之為J亞群(ALV-J)。實(shí)驗(yàn)室和田間試驗(yàn)表明,ALV-J僅引起肉用型雞發(fā)生腫瘤,主要是髓細(xì)胞瘤,最早可在5周齡引起發(fā)病,平均為9周齡,腫瘤致死率在20周齡最高。10年來(lái),該病毒已迅速蔓延到許多國(guó)家,使養(yǎng)雞業(yè)面臨一個(gè)相當(dāng)嚴(yán)重的問題。發(fā)達(dá)國(guó)家的所有肉用型種雞場(chǎng)不得不重新開始實(shí)施一套新的清除ALV-J的計(jì)劃。而我國(guó)作為世界上一個(gè)養(yǎng)雞大國(guó),對(duì)該亞群病毒的感染卻一直無(wú)人問津。不久前,我們分別從某肉用型種雞場(chǎng)的疑似ALV-J的病雞及市場(chǎng)上銷售的臨床健康的肉雞群檢出和分離到ALV-J。測(cè)定了中國(guó)株ALV-J的部分核酸序列并與ALV-J的原型株HPRS-103和美國(guó)分離株ADOL-Hcl進(jìn)行了比較。材料和方法1接種樣品的采集1999年1月至3月期間,從市場(chǎng)上正在屠宰銷售的臨床健康的雞群中采樣,每個(gè)雞群中隨機(jī)采集5～10個(gè)脾臟混合研磨,0.25μm微孔濾膜過濾除菌,即為待接種樣品。從揚(yáng)州市的19個(gè)雞群和宿遷市的6個(gè)雞群中采集了樣品。此外,1999年8月從國(guó)內(nèi)某肉用型種雞場(chǎng)具有肝和脾臟增生性腫大的疑似J型白血病的患雞采集了病料。2adol和agttcaagrtcartac的分子關(guān)系為了從接種病料的CEF中的ALV-J前病毒DNA中擴(kuò)增ALV-J基因組,所用的一對(duì)引物由美國(guó)農(nóng)業(yè)部禽病和腫瘤研究所(ADOL)提供,其正向引物為5′-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT,相當(dāng)于J亞群HPRS-103株基因組cDNA序列的#5394～#5416,反向引物的序列為5′-AGTTGTCAGGGAATCGAC,其堿基相當(dāng)于J亞群HPRS-103株基因組cDNA序列的堿基#8711～#7794。所用單抗為ALV-Jgp85特異性單抗JE9。3雞胚成纖維細(xì)胞的制備在所有的試驗(yàn)中我們都使用0系SPF雞胚制成的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),經(jīng)0.25%的胰酶消化分散后分別分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔細(xì)胞板中,待其形成60%單層時(shí)即可用于接種樣品。4細(xì)胞瓶?jī)?nèi)免疫熒光每份樣品分別接種一瓶細(xì)胞和數(shù)孔96孔板細(xì)胞,維持7天后96孔板用于做免疫熒光反應(yīng),細(xì)胞瓶?jī)?nèi)細(xì)胞經(jīng)消化收獲后,用于提取CEF基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。5免疫組化檢測(cè)96孔板接種病毒并維持7天后用乙醇-丙酮(4∶6)固定,用特異性抗ALV-J單抗JE9(1:500稀釋)作第一抗體,37℃作用45min,PBS洗滌后,再用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(BoehringerMannheimCorp.)作為第二抗體37℃作用45min,經(jīng)PBS洗滌后,在OLMPUSIX-50型熒光倒置顯微鏡下觀察。6adol-pcr檢測(cè)alv-j表達(dá)CEF在接種病毒并維持7天后,將細(xì)胞消化收獲,經(jīng)洗滌、離心沉淀再用抽提緩沖液(100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-ClpH8.0,25mmol/LEDTApH8.0,0.5%SDS)懸浮后,加入蛋白酶K(100μg/ml)消化過夜,再用苯酚抽提,經(jīng)乙醇沉淀后,溶解于TE(10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,pH8.0)中,即為樣品模板DNA(50ng/μl～100ng/μl)。用于擴(kuò)增整合進(jìn)細(xì)胞基因組的ALV-J的前病毒DNA。PCR反應(yīng)程序:在每管總體積為50μl的反應(yīng)混合液中含有以下成分,10×Taqbuffer(MgCl215mmol/L,華美公司)5.0μl;正向引物(25pmol/μl)1.0μl;反向引物(25pmol/μl)1.0μl,模板DNA(50ng/μl～100ng/μl)1.0μl,dNTP(2.5mmoleach/μl華美公司)4.0μl,H2O37.5μl,Taq酶(3U/μl,華美公司)0.5μl。循環(huán)條件:95℃3min,95℃30s,58℃1min,72℃2min,33循環(huán);72℃10min。設(shè)立一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,即已知ALV-J的ADOL-Hcl株感染的細(xì)胞基因組DNA(由美國(guó)ADOL提供)。設(shè)立兩個(gè)陰性對(duì)照:(1)已知A亞群ALV感染的細(xì)胞基因組DNA(由美國(guó)ADOL提供);(2)未感染的0系CEF基因組DNA。7基因組dna的測(cè)序?qū)Z9901株以數(shù)次均從同一份病料感染的CEF中提取的基因組DNA為模板得到的PCR原始產(chǎn)物(約10個(gè)反應(yīng)量),分別送中科院上海植物生理所和大連寶生物公司測(cè)序,所用引物同原PCR的引物。對(duì)SD9902株僅送大連寶生物公司測(cè)序。結(jié)果1pcr檢測(cè)alv-j型面臨的cef/hcl擴(kuò)增的效果在來(lái)自市場(chǎng)上的25個(gè)臨床健康的商品代肉雞樣品接種的CEF中,從4個(gè)雞群(來(lái)自揚(yáng)州市19個(gè)雞群中的2群,宿遷市6群中的2群)的樣品中,用PCR檢出了約2.1kb左右的清晰條帶,與已知ALV-J參考株ADOL-Hcl產(chǎn)生的條帶大小相同。同時(shí),作為陰性對(duì)照的已知ALV-A感染的CEF或用于接種樣品的未感染的CEF基因組DNA不產(chǎn)生相應(yīng)的條帶。兩份疑似J型白血病的患雞病料接種CEF后均檢出2.1kb左右的特異條帶(圖1)。這些毒株分別稱之為YZ9901、YZ9902、SQ9901、SQ9902、SD9901、SD9902株。2a陽(yáng)性反應(yīng)檢測(cè)從二個(gè)肉用型種雞場(chǎng)病雞分離到的SD9901和SD9902病毒株在感染CEF后與抗ALV-J單抗JE9呈現(xiàn)非常強(qiáng)的IFA陽(yáng)性反應(yīng)(圖2)。從揚(yáng)州分離到的兩株病毒YZ9901和YZ9902在感染CEF后,也能與該單抗呈現(xiàn)IFA陽(yáng)性反應(yīng),但熒光強(qiáng)度比來(lái)自病雞的SD9901和SD9902弱;從宿遷分離到的兩株病毒SQ9901和SQ9902在感染CEF后未能在IFA中與該單抗呈現(xiàn)反應(yīng)。顯然,在用PCR檢出的6份疑似ALV-J的陽(yáng)性樣品中,有4份經(jīng)ALV-J特異性單抗所證實(shí)。3alv-j原型株hprs-33的hplc-c本研究測(cè)定了ALV-J的中國(guó)第一個(gè)分離株YZ9901及另一個(gè)急性致病性毒株SD9902的囊膜糖蛋白gp85的部分序列,該片段相當(dāng)于ALV-J原型株HPRS-103的囊膜糖蛋白gp85的第64～371氨基酸間的多肽片段。比較表明,在該區(qū)段內(nèi)YZ9901和SD9902與HPRS-103分別有90%和93%的同源性,與美國(guó)株ADOL-Hcl分別有92%和89%的同源性,它們相互間的同源性也是近92%(表1,圖3)。4急性致腫瘤性srv的鑒定對(duì)這兩個(gè)中國(guó)株病毒基因組的3′端非編碼區(qū)分別做了核酸測(cè)序,該片段序列相當(dāng)于ALV-J原型株HPRS-103基因組堿基#6896～#7745,該區(qū)間包含有僅為急性致腫瘤性RSV所特有的E成分和所有ALV都非常保守的LTR區(qū)。在3′端LTR區(qū)中國(guó)分離毒YZ9901和SD9902株與HPRS-103的同源性高達(dá)95%～97%,但在中國(guó)株YZ9901和SD9902的E成分片段中卻有一段139個(gè)堿基序列的完全缺失,代之以另外一段11個(gè)完全無(wú)關(guān)的堿基序列(圖4)。然而,這兩個(gè)中國(guó)株與另一個(gè)美國(guó)株4817在這一小區(qū)間卻有99%的同源性,在它們發(fā)生缺失性突變的區(qū)段及其上下游,除一個(gè)堿基外,其它完全相同。alv-j在細(xì)胞生物學(xué)特性上的變異J亞群ALV的出現(xiàn)和流行,給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了很大的危害,使全世界各大型肉用型種雞公司不得不耗巨資開始實(shí)施全面清除ALV-J的規(guī)劃。對(duì)一個(gè)種雞公司,這一徹底更新種雞群并最終消除ALV-J在種雞群中感染的規(guī)劃的完成,至少要8～10年的時(shí)間。另一方面對(duì)ALV-J的分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)研究,還可能為腫瘤性病毒的演化提供有普遍生物學(xué)意義的新發(fā)現(xiàn)。如前所述,對(duì)經(jīng)典ALV中Rouse肉瘤病毒(RSV)的深入研究所獲得的數(shù)項(xiàng)里程碑性的發(fā)現(xiàn),曾分別在60年代、70年代、80年代獲得諾貝爾獎(jiǎng)。RSV是一種橫向傳染性較小的急性致瘤性ALV,但近10年中,ALV-J從傳染性強(qiáng)的慢性致瘤性病毒演變出傳染性很強(qiáng)的急性致瘤性病毒。如最早發(fā)現(xiàn)的ALV-J的原型株HPRS-103,經(jīng)孵化11日齡雞胚接種,肉用型雞在出殼后最快也要在64～78日才開始出現(xiàn)髓細(xì)胞瘤或腎瘤造成的死亡,平均經(jīng)142～143天。然而,近幾年出現(xiàn)了一些毒株,在自然感染時(shí)即可能在5周齡的肉用型雞引起髓細(xì)胞瘤死亡,且表現(xiàn)出很高的傳染性和發(fā)病率。在某些種雞場(chǎng),在如此早期開始發(fā)生腫瘤死亡后,平均每周死亡率甚至可能持續(xù)保持在1%左右(Fadly,1998個(gè)人通訊)。顯然,在ALV-J發(fā)現(xiàn)的近10年內(nèi),其致病性發(fā)生了重大的演化。對(duì)ALV的亞群分類主要是根據(jù)其囊膜蛋白的抗原性差異,經(jīng)典A-E亞群間的囊膜蛋白基因(env)的同源性約為85%。但它們的gag和pol基因的同源性很高,在96%～97%左右。ALV-J的env基因與A-E亞群env基因只有40%的同源性,但ALV-J的gag和pol基因仍與A-E亞群有96%～97%的同源性。此外還發(fā)現(xiàn),在ALV-J的env和LTR之間也存在著一個(gè)對(duì)LTR起增強(qiáng)子作用的“E”成分,在其它ALV中只有呈急性致瘤性的RSV才具有這個(gè)E成分。不過該E成分對(duì)ALV-J誘發(fā)髓細(xì)胞瘤的作用還不清楚。最近,從一些品系雞(包括0系)細(xì)胞基因組DNA中檢測(cè)到一類新的ALV的缺陷型前病毒成分ev/J,其pol基因完全缺失,而gag和env基因部分缺失,但其env多肽的部分片段與ALV-J有近95%的同源性,雞基因組上另一個(gè)內(nèi)源性ALV成分EAV-HP也與HPRS-103株的env基因有97%的同源性。因此,人們推測(cè)ALV-J的出現(xiàn)及其不斷變異仍是一些外源性ALV病毒和內(nèi)源性ALV成分重組的結(jié)果。由于ALV-J在大批飼養(yǎng)的商品雞群不斷傳播過程中有很高的變異率,這就為我們提供了一個(gè)很有價(jià)值的系統(tǒng)來(lái)研究病毒基因多樣性的發(fā)生。本研究是國(guó)內(nèi)首次分離到ALV-J病毒,分別經(jīng)對(duì)感染的CEF細(xì)胞基因組DNA的PCR及ALV-J特異性單抗的IFA所證實(shí)。其中兩株來(lái)自大型肉用型種雞場(chǎng)的已表現(xiàn)髓細(xì)胞瘤的患病種雞,另兩株來(lái)自市場(chǎng)上臨床健康的商品肉雞(僅6周齡左右)。這表明ALV-J在我國(guó)確實(shí)存在。在人工致病性實(shí)驗(yàn)中,來(lái)自病雞群的兩株分離毒人工接種1日齡AA肉雞,均可誘發(fā)J亞群典型的髓細(xì)胞腫瘤,其中一株最快可在4周齡內(nèi)引起髓細(xì)胞瘤性肝脾腫大導(dǎo)致死亡(致病性研究結(jié)果另行發(fā)表)。我們測(cè)定了從臨床健康的商品肉雞分離到的并經(jīng)ALV-J特異性單抗JE9所證實(shí)的YZ9901株及從病雞群分離到的SD9902株基因組的部分核酸序列。比較表明,其囊膜蛋白gp85在氨基酸水平與原型株HPRS-103及美國(guó)ADOL-Hc1株有89%～93%的同源性,而HPRS-103和ADOL-Hc1間的同源性也只在91%左右。這表明我國(guó)的YZ9901和SD902株ALV-J的env基因與它們間處在同一變異幅度范圍內(nèi),且相對(duì)集中發(fā)生在高變區(qū)。實(shí)際上,同一毒株在不同實(shí)驗(yàn)室保存并傳代后也很易發(fā)生突變。例如由二個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的ADOL-Hc1株的序列也有2%的變異。在各亞群ALV間相對(duì)比較穩(wěn)定的3′端非編碼區(qū),中國(guó)株病毒與原型株HPRS-103相比,仍相對(duì)比較保守,同源性達(dá)95%～97%。但在與LTR相臨近的E成分中,二個(gè)中國(guó)株卻發(fā)生了一個(gè)139個(gè)堿基片段的缺失性突變,代之以另一段完全無(wú)關(guān)的11個(gè)堿基。這種突變不屬于ALV不斷發(fā)生的隨機(jī)點(diǎn)突變,也顯然與PCR過程中可能發(fā)生的錯(cuò)讀無(wú)關(guān),因?qū)ν徊×细腥镜腃EF分3次做PCR,后分別送兩個(gè)不同單位對(duì)PCR產(chǎn)物共進(jìn)行3次直接測(cè)序,該缺失性突變區(qū)及其上下游的序列完全相同。而且,這二個(gè)中國(guó)株的這一139個(gè)堿基片段的缺失性突變與美國(guó)的分離株4817幾乎完全相同。這一缺失性突變與致病性的關(guān)系有待闡明。然而相對(duì)于HPRS-103株,美國(guó)株4817在堿基#7165上游還有另一大片段的缺失性突變(圖4),而在這一片段內(nèi),二個(gè)中國(guó)株雖有一小段高度可變區(qū),但大部分是與HPRS-10