谷氨酸發(fā)酵生產工藝（發(fā)酵技術課件）

生產菌種工藝控制染菌防治綜合實訓項目五谷氨酸發(fā)酵生產生產菌種谷氨酸短棒桿菌棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。革蘭氏陽性，無芽孢，無鞭毛，不能運動。Oα-酮戊二酸乙酰CoA（C2）草酰乙酸（C4）檸檬酸（C6）α-酮戊二酸（C5）琥珀酸（C4）谷氨酸CO2谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸脫氫酶NH4＋NADPH×CO2葡萄糖丙酮酸α-氨基戊二酸EMP途徑CO2問題：消耗的草酰乙酸如何補充？代謝途徑谷氨酸產生菌株的生化特點：①α-酮戊二酸脫氫酶活性極低或缺失為什么？菌種特點③細胞膜對谷氨酸的通透性高為什么？（不被高濃度的谷氨酸抑制）葡萄糖丙酮酸a－酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4＋抑制葡萄糖EMP途徑TCA循環(huán)中NADPH②谷氨酸脫氫酶活性很高為什么？（不被低濃度的谷氨酸抑制）進行菌種篩選！問題：如何提高細胞膜對谷氨酸的通透性？生物素：脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸的合成。生長因子改造后的生產菌種：生物素缺陷型谷氨酸短棒桿菌菌種改造完全培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基即維生素H、輔酶R，一種小分子維生素，分子量為244，是轉氨甲酰基化過程的輔酶，是羧化、脫羧、脫氫反應酶系的輔酶因子，參與機體三大營養(yǎng)物質代謝。當生物素不足時：不利于不飽和脂肪酸的合成，從而造成細胞膜成分磷脂的不足，使細胞膜結構組成不完全，因而增加了細胞膜的通透性，有利于谷氨酸滲出膜外。影印法篩選生物素缺陷型，限量供給生物素（亞適量），使細胞膜對谷氨酸有良好的通透性。種子擴大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)——主要產生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬生長特點：適用于糖質原料，需氧，以生物素為生長因子。一級種子培養(yǎng)——搖瓶機上振蕩培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)——種子罐培養(yǎng)料液量為發(fā)酵罐投料體積的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃進行通氣攪拌7-10h。種子質量要求：無雜菌污染，菌體大小均一，呈單個或八字排列?；罹鷶禐?08-109/ml。菌種擴培工藝控制谷氨酸發(fā)酵生產工藝①通風（供氧）：菌體生長階段：通風量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長。發(fā)酵產酸階段：需要大量通風供氧；但過大通風，則大量積累a-酮戊二酸；通風不足，則過量生成乳酸、琥珀酸。長菌期低風量、產酸期高風量、成熟期低風量②

NH4+

和pH（中性或弱堿性）谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉氨酶最適pH7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過高轉為谷氨酰胺，過低氨離子不足。通過添加NH4+同時調節(jié)pH種子罐搖瓶補料罐；尿素空氣分過濾器①氧②NH4+③pH發(fā)酵罐④生物素亞適量空氣總過濾器通風NH4+pH谷氨酸發(fā)酵生產工藝③生物素：控制在亞適量：2～3μg/L。當磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量：則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產或少產谷氨酸，代謝產物中乳酸和琥珀酸明顯增多；生物素不足：抑制菌體生長④溫度：三級控制溫度生物素012h24h32~34℃32～33℃34～36℃谷氨酸生產發(fā)酵罐防止噬菌體和雜菌的污染染菌原因噬菌體防控生產和試驗過程中活生產菌到環(huán)境中環(huán)境中的噬菌體噬菌體大量增殖傳播風沙、塵土、空氣生產各個環(huán)節(jié)潛入尤其是通過空氣系統進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐染菌危害噬菌體的感染力很強，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產量大幅度下降，嚴重的造成斷種，被迫停產。防止噬菌體和雜菌的污染染菌表現噬菌體防控染菌檢測雙層平板法1）鏡檢可發(fā)現菌體不規(guī)則，數量明顯減少，且在短時間內菌體大量自溶。2）發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時之內可達8.0以上，不再下降；殘?zhí)巧?。為什么?）發(fā)酵液突然稀薄，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4）產物生成量甚少或增長緩慢或停止.有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗在培養(yǎng)皿上倒入滅菌培養(yǎng)基作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現噬菌斑。下層：無菌培養(yǎng)基上層：培養(yǎng)基＋種子液＋發(fā)酵液（可疑）防止噬菌體和雜菌的污染染菌防治噬菌體防控染菌處理1）必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃；2）車間地面和通往車間的道路盡量采取水泥地面以減少灰塵；3）種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，認真地進行種子保管；4）發(fā)酵罐、補料系統滅菌要徹底。嚴格控制逃液和取樣分析和洗罐所廢棄的菌體。對倒罐所排放的廢液應滅菌后才可排放。5）選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種；為什么？1）環(huán)境：車間四周有嚴重污染噬菌體的地方應及時撒石灰或漂白粉；2）發(fā)酵：發(fā)現噬菌體停止攪拌、小通風，將發(fā)酵液加熱到70℃~80℃殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周圍的管道也必須徹底滅菌。3）廢液：嚴格控制逃液、樣液和洗罐所廢棄的菌體。對倒罐所排放的廢液應滅菌后才可排放。發(fā)酵產品生產菌種易染雜菌谷氨酸短棒桿菌噬菌體檸檬酸黑曲霉青霉菌抗生素放線菌、霉菌短桿菌，產氣桿菌，假單孢菌酒類釀酒酵母野生酵母，醋酸菌、乳酸菌酒精酵母菌醋酸菌，乳酸菌染菌防治檢查方法（1）顯微鏡檢查：染色→鏡檢無法發(fā)現染菌初期的雜菌，為什么？（2）無菌試驗取樣1次/8h；檢查1次/6h①平板劃線檢查（雙碟法）：倒平板→空培養(yǎng)→待測樣品劃線→培養(yǎng)觀察②酚紅肉湯培養(yǎng)檢查：無菌肉湯培養(yǎng)基空培養(yǎng)→接入樣品→培養(yǎng)觀察③雙層平板法：用于檢查噬菌體（3）通過發(fā)酵的生理生化指標檢查（4）試劑盒檢驗法檢查方法檢查方法優(yōu)點缺點顯微鏡檢查簡便、快速取樣少，視野小，不易檢出早期雜菌培養(yǎng)法可檢出早期雜菌較長時間培養(yǎng)，且操作較繁瑣生理生化指標檢查可及早發(fā)現與預測染菌需建模試劑盒檢驗快速、高效、專一性強費用高方法比較檢查原則實驗為主，鏡檢為輔：檢查結果以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結果為主要根據平板劃線和肉湯培養(yǎng)應做三個平行樣；定時取樣、定時觀察：取樣1次/8h；檢查1次/6h酚紅肉湯和平板劃線培養(yǎng)樣品應保存至放罐后12小時，確定為無菌時方可棄去要嚴格的無菌操作，取樣時防止外界雜菌混入的措施。染菌的主要途徑：1.原料方面：滅菌不徹底2.種子方面：種子帶菌3.無菌空氣：空氣帶菌4.補料系統：補料或管路帶菌5.設備方面：設備滲漏主要途徑2種子罐2搖瓶4補料罐3空氣總過濾器3空氣分過濾器2斜面5設備管道1發(fā)酵罐原料染菌的主要途徑：1.原料方面：滅菌不徹底2.種子方面：種子帶菌3.無菌空氣：空氣帶菌4.補料系統：補料或管路帶菌5.設備方面：設備滲漏防治措施發(fā)酵染菌的防治措施：1.培養(yǎng)基滅菌徹底2.杜絕種子帶菌3.防止無菌空氣帶菌3.補料滅菌徹底5.防止發(fā)酵設備的死角與滲漏6.嚴格操作管理（人為因素）染菌的處理（挽救）原則：1、對染菌的種子培養(yǎng)基處理：一般均應滅菌后堅決棄去，并對接觸過的設備，管道全部滅菌，加長滅菌時間等。2、對染菌的發(fā)酵培養(yǎng)基處理：發(fā)酵前期染菌（最易染菌，且危害最大）應迅速再次滅菌，補充必要營養(yǎng)成分，重新接種；發(fā)酵中期染菌（染菌機會較?。褐饕ㄟ^調節(jié)工藝條件來挽救，如降低發(fā)酵溫度；減少補料等。發(fā)酵后期染菌（不易染菌）：應提前放罐，或者加入一些殺菌劑（如抗生素）來抑菌。3、對染菌后的設備處理：用甲醛熏蒸、蒸汽消毒處理挽救案例分析：某藥廠進行抗生素發(fā)酵生產，在發(fā)酵原料補充采購時，其中一種原料批號更換，結果在隨后近半年時間內，發(fā)酵生產期間經常間歇性污染芽孢桿菌，但是在接種之前檢查菌種液時并無異常發(fā)現，多次檢查生產設備均無問題，給生產造成極大影響。請問染菌的原因可能是哪些方面？如果檢查結果是：①滅菌壓力和溫度正常；②工具包裝及滅菌時間正常；③操作間塵降菌符合要求；④空氣過濾系統正常；⑤補料系統正常；⑥員工操作無誤。那么，你認為最有可能的染菌原因是什么？為什么？綜合實訓（一周）菌種：谷氨酸產生菌BL-115或其他高產菌種（購買）菌種擴培結束放罐清潔整理休眠狀態(tài)活化10支/班種子培養(yǎng)基1000ml；分裝于20個250ml三角瓶中，每瓶裝量50ml發(fā)酵培養(yǎng)基30-35L罐容量50L放出發(fā)酵液，用于產品提取清洗發(fā)酵罐等菌種擴培總計時：60h（實驗員活化；一級種子培養(yǎng)星期一——星期二）培養(yǎng)48h32℃冷藏菌種新制斜面一級種子接種生產250rpm振蕩培養(yǎng)32℃12h發(fā)酵生產32-34℃，,36h菌種擴大培養(yǎng)實罐滅菌操作：檢查設備清洗標定電極加入30-35L發(fā)酵培養(yǎng)基（預先配好）蒸汽預熱加熱滅菌冷卻待用實罐滅菌50L機械攪拌通風發(fā)酵罐主控機柜蒸汽、冷卻水、排污等管道接種——火焰圈接種法取空白樣——接種前取0號樣——接種后立即取樣離線檢測0號樣——殘?zhí)?、OD值（菌體濃度）、鏡檢（菌體形態(tài)）在線監(jiān)控參數——溶氧、溫服、pH值、泡沫等發(fā)酵生產每次取樣液約50-60ml發(fā)酵生產

上罐實消配制發(fā)酵培養(yǎng)基

冷卻接種

固體斜面培養(yǎng)菌種

三角瓶振蕩培養(yǎng)

發(fā)酵液發(fā)酵過程參數控制DO值

pH

溫度

泡沫發(fā)酵過程參數監(jiān)測還原糖的測定谷氨酸含量的測定（略）*菌體形態(tài)觀察菌體濃度測定