酶生產(chǎn)的下游工藝-發(fā)酵液的預處理

模塊三、酶生產(chǎn)的下游工藝酶制劑生產(chǎn)技術引入

微生物經(jīng)過好氣性發(fā)酵和厭氧發(fā)酵培養(yǎng)后，菌體會大量繁殖，并合成和積累了相當濃度的代謝產(chǎn)物，這時便終止發(fā)酵，進入分離加工過程。

不管是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外代謝產(chǎn)物，在分離純化目的產(chǎn)物時，首先都要通過發(fā)酵液的預處理。將固相、液相分離后，才能采用各種物理、化學、生物的方法進行產(chǎn)物的進一步分離純化。學習情境九發(fā)酵液的預處理工作任務（一）酶的分離純化概述工作任務（二）發(fā)酵液的預處理

酶得分離和純化是酶生產(chǎn)的下游工程，是將酶從細胞或培養(yǎng)基中取出與雜質(zhì)分離開，而獲得符合使用要求的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程。分離純化

（separationandpurification）工作任務（一）酶的分離純化概述濃縮的發(fā)酵液防止酶變性失效1、低溫操作2、避免過酸過堿:確定合適的緩沖容量的緩沖溶液

3、避免重金屬、有機溶劑、微生物污染、蛋白水解酶等破壞分解酶選擇有效的純化方法酶與其底物和抑制劑具有高親和性，因此可使用各種親和分離法；而且，當這些物質(zhì)存在時，酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性往往會發(fā)生一些有利的變化，這樣又擴大了純化方法與純化條件的選擇范圍。酶活性測定貫穿純化過程的始終酶活性測定貫穿純化過程的始終。通過檢測酶活性可以跟蹤酶的來龍去脈，為酶的抽提、純化、以及選擇制劑過程中的正確方法條件提供直接依據(jù)。酶的分離純化注意的問題為什么？何溫度適宜？工作任務（一）酶的分離純化概述酶的分離純化過程預處理（pretreatment）：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等工作任務（一）酶的分離純化概述發(fā)酵液預處理是指采用凝集、絮凝、加熱、稀釋法等技術來加速固相、液相分離。過濾和離心是其最基本的單元操作。

發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵液中的濃度較低，并與大量可溶的和混懸的雜質(zhì)混雜在一起。發(fā)酵液黏度大，過濾性能差，所以在過濾前必須進行預處理。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理1產(chǎn)物濃度低，有的甚至在1%以下2發(fā)酵液中的懸浮固形物主要是菌體和蛋白的膠狀物，粘度大，不易過濾，增加了后續(xù)的難度表面張力大3性質(zhì)不穩(wěn)定：發(fā)酵液中含有少量的代謝副產(chǎn)物，其結構、理化特性與目標物極為相似，會對后續(xù)操作有影響。發(fā)酵液的基本特性工作任務（二）發(fā)酵液的預處理預處理的目的1改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率；2盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）；3去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液預處理的要求1、菌體分離發(fā)酵液中除發(fā)酵產(chǎn)物外，還含有大量的菌體，為方便提取和精制，首先要將菌體與發(fā)酵液分離。為保證離心和過濾順利進行，要正確控制發(fā)酵終點。否則對目標物的回收均不利。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理工作任務（二）發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液預處理的要求2、固體懸浮物的去除通過過濾處理，將發(fā)酵液中相當數(shù)量的固體懸浮雜質(zhì)去除，獲得透光度合格的澄清處理液。3、蛋白質(zhì)的去除

發(fā)酵液中去除菌體和固體懸浮物后，一些可溶性蛋白質(zhì)仍留在濾液中，需設法去除。除去蛋白質(zhì)的濾液要保證在一定的pH范圍內(nèi)不發(fā)生混濁，否則影響溶媒提取和離子交換提取。發(fā)酵液預處理的方法

加熱調(diào)節(jié)pH值凝聚和絮凝使用惰性助濾劑高價態(tài)無機離子去除的方法可溶性雜蛋白的去除法工作任務（二）發(fā)酵液的預處理前提：熱穩(wěn)定性高的發(fā)酵液。方式：最簡單和廉價的預處理方法。將發(fā)酵液加熱至所需溫度并保持一定時間。效果：降低發(fā)酵液黏度，加速聚集作用以除去熱變性雜蛋白，破壞凝膠狀膠體結構，增加濾餅孔隙率，減少發(fā)酵液體積，達到固液分離的目的。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理加熱法調(diào)節(jié)pH值例：去除四環(huán)素中鈣、鎂離子，四環(huán)素能與鈣、鎂形成不溶解的化合物，沉積在菌絲體內(nèi)，用草酸酸化后，能將其轉(zhuǎn)入水相。pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預處理較常用的方法之一。

例：利用酸堿性來調(diào)整pH值使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)達到等電點得以除去。又如過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染。

工作任務（二）發(fā)酵液的預處理凝集和絮凝這兩項技術能有效地改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)、使之聚集，增大體積，利于過濾，常用于菌體細小且粘度大的發(fā)酵液預處理中。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理

凝集是指在投加的化學物質(zhì)作用下，發(fā)酵液中的膠體脫穩(wěn)并使粒子相互凝集成為1mm大小塊狀絮凝體的過程。凝集劑的作用：粒子表面電荷的簡單中和；消除粒子表面穩(wěn)定的雙電荷層；通過氫鍵或其它復雜的形式與粒子結合。最終使膠體粒子的排斥電位降低而發(fā)生聚沉。

凝集和絮凝工作任務（二）發(fā)酵液的預處理凝聚過程凝集和絮凝工作任務（二）發(fā)酵液的預處理絮凝指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成10mm大小絮凝團的過程。

絮凝的作用增大發(fā)酵液中懸浮粒子的體積；提高固液分離速度和濾液質(zhì)量。絮凝是一種以物理的集合為主的過程。凝集和絮凝聚丙烯酰胺絮凝劑工作任務（二）發(fā)酵液的預處理常用凝聚劑——高價陽離子

凝聚能力的次序為：

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用電解質(zhì)：Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgSO4發(fā)酵液的預處理凝集和絮凝工作任務（二）發(fā)酵液的預處理常用絮凝劑：人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亞胺的衍生物無機高分子聚合物：聚合鋁鹽、聚合鐵鹽天然有機高分子絮凝劑：殼聚糖、葡聚糖、明膠、骨膠微生物絮凝劑：糖蛋白，粘多糖，纖維素，核酸發(fā)酵液的預處理凝集和絮凝工作任務（二）發(fā)酵液的預處理影響絮凝的因素絮凝劑的濃度：低濃度時，增大濃度有利于絮凝，但濃度過大同樣會產(chǎn)生反作用；絮凝劑的分子量：絮凝劑分子量在，鏈越長，吸附架橋效果越好，但在水中溶解度減小會對絮凝不利，故應分子量適當?shù)男跄齽蝗芤旱膒H：影響絮凝劑活性基團的解離，應選擇合適pH值，使絮凝劑解離度最大，作用最好。攪拌速度和時間：攪拌速度和時間要控制在一個合理范圍發(fā)酵液的預處理凝集和絮凝工作任務（二）發(fā)酵液的預處理加入助濾劑法作用：避免濾布或生成的濾餅阻塞而影響過濾。從發(fā)酵液中分離菌體、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時，懸浮物細小易受壓，易阻塞或粘住過濾介質(zhì)的細孔。加入助濾劑后，能在過濾介質(zhì)和要分離的固形物之間形成一層不可壓縮的多孔且極為細密的濾層，從而截留懸浮雜質(zhì)。還能使形成的濾餅疏松，具有較大孔隙，形成暢通的細密管道。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理加入助濾劑法助濾劑的使用方法：在濾布上預涂一層助濾劑，作為過濾介質(zhì)使用，待濾畢后與濾餅一起除去；助濾劑按一定比例均勻地混入待濾的懸浮液中，然后一起進入過濾機，使其形成較松的濾餅，降低其可壓縮性，讓濾液可以順暢流通。用作惰性助濾劑的材料：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣或這些材料的混合物。要根據(jù)目的產(chǎn)物、過濾介質(zhì)及過濾情況來選擇助濾劑的品種、助濾劑的粒度、用量。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理高價態(tài)無機離子去除的方法Ga2+：加入草酸和草酸鹽，生成草酸鈣；加入磷酸鹽，生成磷酸鈣Mg2+：加入草酸；加入磷酸鹽，生成磷酸鎂；三聚磷酸鈉（Na5P3O10），生成可溶性絡合物Fe3+：加入黃血鹽，生成普魯士蘭沉淀工作任務（二）發(fā)酵液的預處理可溶性雜蛋白的去除法變性沉淀適于熱穩(wěn)定物質(zhì)加熱使蛋白質(zhì)變性，其空間結構發(fā)生改變，疏水基團暴露，溶解度降低易產(chǎn)生沉淀。在目標產(chǎn)物耐熱允許的范圍內(nèi)，采用加熱并保持一定時間，可去除可溶性雜蛋白。例：去除鏈霉素中雜蛋白

pH值3.0，溫度70℃,時間0.5h，使黏度降為原來的1/6，過濾速度提高10～100倍。工作任務（二）發(fā)酵液的預處理等電點沉淀根據(jù)蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，在等電點時溶解度最低，易產(chǎn)生沉淀，用酸或堿調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使其達到蛋白等電點而沉淀。但有些蛋白質(zhì)在等電點時仍有一定的溶解度，還要結合其它的化學方法?？扇苄噪s蛋白的去除法工作任務（二）發(fā)酵液的預處理例：在枯草桿菌的堿性蛋白發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鹽，會生成磷酸鈣沉淀，此沉淀能吸附雜蛋白，同時還能起助濾劑作用?？扇苄噪s蛋白的去除法吸附法利用吸附作用分離除去雜蛋白質(zhì)。一般情況下，通過各種物理化學作用產(chǎn)生的沉淀均可吸附一定量的雜蛋白工作任務（二）發(fā)酵液的預處理化合沉淀法

蛋白質(zhì)在酸性溶液中，能與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在