啤酒酵母細(xì)胞壁中磷酸酯類化學(xué)成分的提取與結(jié)構(gòu)

啤酒酵母細(xì)胞壁中磷酸酯類化學(xué)成分的提取與結(jié)構(gòu)

20世紀(jì)40年代，皮爾曼博士首次發(fā)現(xiàn)并報道了關(guān)于改進(jìn)海水溫度的藥物。后來，通過美國圖倫大學(xué)的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)縮短母系膜的阻力物質(zhì)是-（1,3）-d-葡萄糖。β-(1,3)-D-葡聚糖是一種極富生物活性免疫多糖,已證實對腫瘤、肝炎、糖尿病、心血管、高血脂等病癥都有治療效果。由于其具靈芝、灰樹花、香菇多糖功效結(jié)構(gòu),因此被有些科學(xué)家稱為“超級靈芝”,是一種極具發(fā)展前景微生物多糖。2006年我國啤酒產(chǎn)量3,515萬千升,可得干燥啤酒酵母5萬多噸,啤酒酵母細(xì)胞壁中含有大量β-(1,3)-D-葡聚糖,約占酵母細(xì)胞壁干重45%。目前日本、美國等國都對其進(jìn)行大量深入研究,已將提取出β-(1,3)-D-葡聚糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)品養(yǎng)殖、化妝品等領(lǐng)域。我國廢酵母泥大多被作為廉價粗飼料處理或直接排放,造成很大資源浪費和環(huán)境污染。因此,尋求和優(yōu)化一種高效提取方法,對于進(jìn)一步提高β-(1,3)-D-葡聚糖產(chǎn)量和品質(zhì),減少資源浪費和環(huán)境污染,創(chuàng)建節(jié)約型和諧社會具有非常重要意義。1堿溶性葡聚糖電子顯微鏡觀察顯示,啤酒酵母細(xì)胞壁有三層結(jié)構(gòu),最外層是甘露聚糖,中間是蛋白質(zhì),最內(nèi)層是β-葡聚糖,層與層之間可部分鑲嵌(見圖1)。甘露聚糖是高度分支多聚體,以α-(1,6)鍵合D-甘露聚糖為主鏈,同中間層蛋白質(zhì)和磷酸酯連在一起形成磷酸甘露聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物中蛋白質(zhì)具有一定特性,蘇氨酸和絲氨酸含量較高。甘露聚糖大量碳水化合物短鏈與多肽殘基上羥基結(jié)合,形成O-糖苷鍵,該鍵在堿性條件下很穩(wěn)定,不易斷裂。又由于與甘露聚糖相連多肽為堿溶性,因此該復(fù)合物能以整體形式溶于堿性溶液中。O-糖苷鍵在酸性條件下不穩(wěn)定,易分解成甘露聚糖和蛋白質(zhì)兩個獨立成分,而這兩種成分在弱酸性條件下不溶于水。若使用強(qiáng)酸,則易造成葡聚糖大量分解。因此,通過研究外層復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì),可合理制定提取工藝。在提取β-(1,3)-D-葡聚糖過程中,不僅要研究外層復(fù)合物,還要清楚內(nèi)層提取物結(jié)構(gòu)性質(zhì)。Bacon于1969年提出酵母葡聚糖是由以β-(1,3)-D-葡聚糖為主鏈,β-(1,6)-D-葡聚糖為輔組成。Manmers等于1973年提出85%堿不溶性葡聚糖是由β-(1,3)鍵連接,同時穿插3%β-(1,6)葡聚糖苷鍵。Kopecka等于1974年應(yīng)用從環(huán)狀芽孢桿菌中提取純化內(nèi)-β-(1,3)-D-葡聚糖酶和內(nèi)-β-(1,6)葡聚糖酶消化細(xì)胞壁,暴露出細(xì)胞壁內(nèi)層纖維層,得出內(nèi)層主要為β-(1,3)-D-葡聚糖這一結(jié)論。在葡聚糖與其它物質(zhì)連接中,Kapteyn于1997年提出β-(1,6)葡聚糖鏈?zhǔn)紫雀街诩?xì)胞壁蛋白上葡萄糖磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合位點末端,而后這些β-(1,6)葡萄糖基化的甘露糖蛋白又交聯(lián)到β-(1,3)-D-葡聚糖網(wǎng)絡(luò)中。酵母細(xì)胞壁中葡聚糖分為堿不溶性、堿溶性、酸溶性三種。堿不溶性葡聚糖是以β-(1,3)-D-葡聚糖為主鏈含有β-(1,6)分支的葡聚糖;堿溶性葡聚糖是指β-(1,3)-D-葡聚糖;酸不溶性葡聚糖是以β-(1,6)-D-葡聚糖為主鏈,中間插有β-(1,3)鍵的葡聚糖。2超聲波提取法目前,國內(nèi)外對酵母細(xì)胞壁葡聚糖提取方法較多,主要有酸法提取、堿法提取、酸堿一體法、有機(jī)溶劑提取、超聲波提取、酶法等。各種方法各有利弊,優(yōu)缺點明顯。2.1離心除雜、脫色稱取干燥后啤酒酵母渣,加入0.5mol/L乙酸溶液,在50℃下反應(yīng)3h,離心處理,沉淀物水洗2次,然后用無水乙醇洗滌脫色,無水乙醚洗滌脫水,噴霧干燥即可。李祥等(2004)運用該法研究發(fā)現(xiàn),實驗得到是酸不溶性葡聚糖,多糖得率比堿法高;但產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、甘露聚糖等雜質(zhì)含量多,需進(jìn)一步純化,工藝復(fù)雜。2.2乙醇制備工藝準(zhǔn)確稱取啤酒干酵母,加入1mol/L氫氧化鈉溶液,在90℃下水解反應(yīng)3h,水解液過濾,沉淀物水洗2次,然后用無水乙醇洗滌脫色,無水乙醚洗滌脫水,噴霧干燥即可。廖鮮艷等(2001)對此工藝進(jìn)行分析,得到較優(yōu)堿處理組合:第一次條件,氫氧化鈉濃度3%,添加量6v/w(液固比),作用溫度75℃,作用時間3h;第二次條件,氫氧化鈉濃度3%,添加量4v/w,作用溫度100℃,作用時間2h。該法得到是堿不溶性葡聚糖,多糖得率低:但雜質(zhì)含量少,污染較大,耗能較高。2.3-1,3,4-三-葡聚糖的制備稱取啤酒干酵母粉,加入1mol/L氫氧化鈉溶液,添加量為20v/w(液固比),75℃下水解反應(yīng)3h,冷卻至室溫,經(jīng)4000r/min離心5min,沉淀物水洗2次,再用4%乙酸溶液200ml室溫下處理沉淀物2h,離心;沉淀物水洗2次,無水乙醇脫色,無水乙醚脫水,噴霧干燥即可。黃剛良等(2003)運用該法與酸法提取進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)酸堿法是提取β-(1,3)-D-葡聚糖理想途徑,得到葡聚糖純度較高,質(zhì)量較好;但該過程葡聚糖分子降解較明顯。2.4葡聚糖分散液制備法廢酵母泥處理并自溶,4000r/min離心分離,沉淀物用中性蛋白酶57℃處理24h,再離心分離,沉淀物加入2%氫氧化鈉在60℃下處理3.5h后,離心、水洗、去脂、干燥。趙光遠(yuǎn)等(1997)用此工藝進(jìn)行研究,認(rèn)為該法葡聚糖純度較高,尤其是蛋白質(zhì)含量低;但能耗較高,污染大。2.5葡聚糖提取法稱取100g啤酒酵母泥,加入50ml蒸餾水進(jìn)行超聲波處理,條件為功率400W,溫度20℃,超聲時間5s,全程時間20min,無間隔時間,處理后冷卻至室溫,4000r/min條件離心15min,沉淀物用蒸餾水洗滌,無水乙醇脫色,無水乙醚脫水,在37℃條件下干燥12h后得到產(chǎn)品。張開誠(2004)運用該法研究認(rèn)為,超聲波法提取葡聚糖工藝簡便,成本低廉,收率較高,提取后廢液不含酸堿,對環(huán)境污染較酸堿法要小;但其產(chǎn)品純度不高,還需進(jìn)一步研究優(yōu)化提取條件,提高產(chǎn)品純度。在工業(yè)化生產(chǎn)中,可根據(jù)不同生產(chǎn)目的采用不同工藝流程,如酸法由于產(chǎn)量大、純度低,特別適于飼料添加劑生產(chǎn),其葡聚糖產(chǎn)品可用于魚、雞等飼料中;堿法或酸堿法產(chǎn)品可用作營養(yǎng)保健品、化妝品等添加劑;而酶-堿法由于其純度較高,可用于進(jìn)一步葡聚糖深加工,如醫(yī)藥級、化學(xué)試劑等。超聲波法由于超聲設(shè)備等不是很成熟,目前僅停留在實驗室階段。3brms在免疫系統(tǒng)中的應(yīng)用酵母β-(1,3)-D-葡聚糖是一種良好生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRMs),它能通過刺激免疫系統(tǒng)而提高機(jī)體免疫能力,BRMs在相互依賴機(jī)體系統(tǒng)中,對維持體內(nèi)平衡非常關(guān)鍵(如神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)),能幫助機(jī)體適應(yīng)環(huán)境和心理壓力。但人體自身無法合成β-(1,3)-D-葡聚糖,因此將它們成功分離提取,以用于抗真菌治療具有重要意義。3.1氨基酸c-d-葡萄糖的藥理學(xué)應(yīng)用3.1.1活性化合物質(zhì)構(gòu)利用分子力學(xué)(MM2)計算二糖結(jié)構(gòu)單元全局最低能量現(xiàn)象,并進(jìn)行分子幾何全優(yōu)化,表明能量最低構(gòu)象為單螺旋結(jié)構(gòu),且多羥基基團(tuán)位于螺旋表面,因此該種構(gòu)象是刺激免疫和抗腫瘤活性基礎(chǔ)。且多糖骨架鏈上占優(yōu)勢的交替(1,3)鍵連接,且具有(1,6)鍵分支β-葡聚糖更有明顯抗腫瘤活性。經(jīng)X-衍射和核磁共振分析證明,具有三個螺旋構(gòu)象β-(1,3)-D-葡聚糖上多羥基基團(tuán)是抗腫瘤活性靶點,能增強(qiáng)肌體免疫活性,起到預(yù)防和治療癌癥作用。3.1.2-1,3-d-葡聚糖微粒從某種程度上講,由于其不是人體中存在物質(zhì),因而能顯著刺激并提高免疫體活性。β-(1,3)-D-葡聚糖微粒通過與巨噬細(xì)胞結(jié)合進(jìn)而觸發(fā)免疫機(jī)制,從而誘導(dǎo)骨髓白細(xì)胞產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞攻擊并吞噬有害入侵物;動員免疫細(xì)胞運動到異物處,提高巨噬細(xì)胞吞噬能力,并把命令傳遞給下一個免疫系統(tǒng)。3.1.3添加-1,3,3-d-葡聚糖對大鼠血清愈傷組織的影響可作為皮膚臨時替代物促進(jìn)傷口愈合,由于巨噬細(xì)胞活性在外科和傷口愈合上起到重要作用,因此添加β-(1,3)-D-葡聚糖能增強(qiáng)抗感染能力,增強(qiáng)愈傷組織能力,強(qiáng)化愈傷組織發(fā)揮作用。3.1.4其他方面β-(1,3)-D-葡聚糖可降低膽固醇效應(yīng);增強(qiáng)機(jī)體抗輻射及降低血脂作用;可用作藥物緩釋系統(tǒng)。3.2作為食品添加劑β-(1,3)-D-葡聚糖能改善食品質(zhì)地,可用作食品增稠劑、脂肪替代物,還可作為食品中膳食纖維來源,是一種非常優(yōu)良食品添加劑,具有很大發(fā)展前景。3.3葡聚糖特異性受體β-(1,3)-D-葡聚糖能增強(qiáng)水產(chǎn)動物非特異性免疫系統(tǒng),水產(chǎn)動物機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞表面上存在著一個β-(1,3)-D-葡聚糖特異受體,當(dāng)β-(1,3)-D-葡聚糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合后,激活巨噬細(xì)胞活性,通過吞噬作用吸收、破壞和清除體內(nèi)病原微生物,提高水產(chǎn)動物免疫功能。β-(1,3)-D-葡聚糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可減少水產(chǎn)動物,尤其是魚、蝦病害,在水產(chǎn)動物飼料中添加葡聚糖會大大增加水產(chǎn)動物對疾病抵抗力。3.4遺傳物質(zhì)起核心作用β-(1,3)-D-葡聚糖可作為生命活動中起核心作用遺傳物質(zhì),能控制細(xì)胞分裂和分化,將其添加到化妝品中,可利用其免疫調(diào)節(jié)活性促進(jìn)皮膚再生,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,從而達(dá)到抗衰老作用。4加強(qiáng)微生物酶活性研究我國是啤酒生產(chǎn)大國,有著巨大廢啤酒酵母資源,因此,優(yōu)化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝,探求新的提取技術(shù),在節(jié)能降耗和減少環(huán)境污染基礎(chǔ)上,得到高品質(zhì)β-(1,3)-D-葡聚糖具有重大意義。加強(qiáng)甘露聚糖及其與