細(xì)胞衰老過程中dna甲基化及甲基轉(zhuǎn)移酶dnm1表達(dá)的改變

細(xì)胞衰老過程中dna甲基化及甲基轉(zhuǎn)移酶dnm1表達(dá)的改變

細(xì)胞衰老是一種不可逆轉(zhuǎn)的生長(zhǎng)停滯，是人類衰老和年齡疾病的基本原因。體外培養(yǎng)的正常人成纖維細(xì)胞具有限定的增殖潛力，經(jīng)過連續(xù)傳代后逐漸變得衰老，即為細(xì)胞復(fù)制性衰老。此外，多種應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的發(fā)生，過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)最常用于獲得短時(shí)期內(nèi)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰。目前，衰老細(xì)胞的一些生物學(xué)特征，如端?？s短、形態(tài)學(xué)改變、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)等已得到很好的闡述，然而，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入永久停滯狀態(tài)的內(nèi)在分子機(jī)制仍不清楚?；蚪MDNA甲基化狀況是基因表觀遺傳微環(huán)境的基礎(chǔ)之一，在細(xì)胞衰老的過程中，基因組DNA甲基化的變化具有其特定的規(guī)律。研究表明，特定基因調(diào)控位點(diǎn)甲基化的累積作用于細(xì)胞衰老，基因組DNA的甲基化狀態(tài)影響細(xì)胞衰老過程中基因表達(dá)，染色質(zhì)組裝等。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase1,DNMT1)參與維持基因組DNA的甲基化狀態(tài)。本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)比細(xì)胞復(fù)制性衰老及過氧化氫誘導(dǎo)的早衰過程中基因組DNA甲基化水平的變化，同時(shí)檢測(cè)DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)變化，觀察兩種衰老過程中基因組DNA甲基化水平及DNMT1表達(dá)的差異。1材料和方法1.1材料表面人胚肺成纖維細(xì)胞(16PDL)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;細(xì)胞受試物為質(zhì)量濃度30%H2O2(M/V)購自英國BDH公司。1.2細(xì)胞復(fù)制性衰老人胚肺成纖維細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%的新生小牛血清L-DMEM低糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，詳見文獻(xiàn)。以公式n=3.32(logN2-logN1)+X計(jì)算群體倍增水平(populationdoublinglevels,PDL)，n為繼代培養(yǎng)最終PDL,N2為該代細(xì)胞收獲細(xì)胞數(shù)，N1為上代接種細(xì)胞數(shù)，X為上代細(xì)胞PDL。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，正常人胚肺成纖維細(xì)胞分為22PDL(年輕細(xì)胞組)，35PDL(中年細(xì)胞組)，49PDL(復(fù)制性衰老細(xì)胞組)。同步培養(yǎng)22PDL正常人胚肺成纖維細(xì)胞約50%融合度時(shí)進(jìn)行400μmol/LH2O2處理，每天用H2O2染毒工作液染毒1次，每次2h，共持續(xù)4d。經(jīng)H2O2染毒4次后，繼續(xù)培養(yǎng)7d，進(jìn)入明顯早衰持續(xù)狀態(tài)，分為早衰起始組(prematuresenescenceinitiationgroup,PSi，染毒4次后)和早衰持續(xù)組(prematuresenescencepersistencegroup,PSp，繼續(xù)培養(yǎng)7d)。1.35脈沖指數(shù)檢測(cè)應(yīng)用5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)抗體結(jié)合甲基化的DNA，原位檢測(cè)DNA甲基化情況。去除培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS)清洗1次;4%多聚甲醛常溫固定細(xì)胞至少15min;去離子水清洗3次，每次5min;冷甲醇固定5min;去離子水清洗1次5min;2NHCl于37℃孵育30min;去離子水清洗1次5min;1×TBE緩沖液室溫孵育5min;去離子水清洗1次5min;1×PBS清洗1次5min;37℃于Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)含牛血清白蛋白(BSA,1%)中孵育30min;用PBST-BSA(含1%)稀釋一抗，于37℃孵育1h;PBST清洗3次，每次5min;加入PBST稀釋的二抗、異硫氫酸熒光素(fluoresceineisothiocyanate,FITC)標(biāo)記，于37℃孵育30min;PBST清洗3次，每次5min;于0.2mg/ml熒光染料DAPI中染色2min;PBS清洗3次，每次5min;用抗熒光萃滅劑(FluoAntifadingMediumⅡ)封片，于熒光顯微鏡下觀察。于50μlEp反應(yīng)管中加入2μl(0.2μg)樣品DNA,4USssI甲基化酶，1.5μmol/L未標(biāo)記的SAM和SssI反應(yīng)液，補(bǔ)水至25μl總體系，37℃孵育4h;同步，于50μlEp管中加入2μl(0.2μg)樣品DNA,8U甲基酶Dam,1.5μmol/L3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)，1.5μmol/L未標(biāo)記的SAM和Dam反應(yīng)液，補(bǔ)水至25μl,37℃孵育4h;上述混合物分別于80℃溫育20min終止反應(yīng);將反應(yīng)混合液加入Millipore96孔板中，每孔中加入0.3ml5%三氯乙酸和0.3ml70%乙醇真空抽吸3次，洗去未結(jié)合DNA的3H-SAM。取出板的底座，每孔加入固體閃爍液100μl，在microbeta液閃儀器上檢測(cè)每個(gè)孔對(duì)應(yīng)的脈沖指數(shù)(centsperminute,CPM)值。根據(jù)公式%甲基CpG=(1-SssI/3.2dam比值)×100來計(jì)算基因組甲基化程度。1.5dnmt1的性能變化1.5.1熒光定量pcr和反轉(zhuǎn)錄合成dna應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen)提取細(xì)胞總RNA,MMVReverseTranscriptionKit(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR采用SYBRue5f8PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(TaKaRa)試劑。DNMT1上游引物5′-CCCCTGAGC-CCTACCGAAT-3′，下游引物5′-CTCGCTGGAGTG-GACTTGTG-3′;內(nèi)參ACTB上游引物5′-TGAC-CCAGATCATGTTTGAG-3′，下游引物5′-ATCTCTT-GCTCGAAGTCCAG-3′。1.5.2westernblot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平采用RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl,pH=7.5,150mmol/LNaCl,1%NonidetP40,0.5%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS)提取細(xì)胞總蛋白，一抗DNMT1(rabbit,Sigma)，GAPDH(sc-32233,SantaCruz)，二抗goatanti-rabbitIgG-HRP(sc-2031,SantaCruz)，goatanti-mouseIgG-HRP(sc-2005,SantaCruz)，進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平變化。1.6兩組本間的比較數(shù)據(jù)用x珋±s表示，采用Student’st-test檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本之間的比較，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05.2結(jié)果2.15不同年齡處理的基因組dna甲基化水平利用5-甲基胞嘧啶抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，觀察甲基化DNA的定位及進(jìn)行各組之間平均熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)的比較，從而檢測(cè)基因組DNA甲基化的變化趨勢(shì)。如圖1所示，在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，年輕細(xì)胞組平均熒光強(qiáng)度為56.7，中年細(xì)胞組有所降低為41.5，而復(fù)制性衰老細(xì)胞組降低明顯為20.3,5-mC免疫熒光強(qiáng)度隨增齡逐漸降低;早衰組細(xì)胞也呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，早衰起始組為48.6，而早衰持續(xù)組為23.1。因此，與年輕細(xì)胞相比，衰老的細(xì)胞具有較低的基因組DNA甲基化水平。利用液閃計(jì)數(shù)的原理，檢測(cè)基因組DNA的總體5-mC內(nèi)容物含量，從而確定基因組DNA的甲基化水平的改變，摻入[3H]甲基SAM的量越多，表明基因組DNA的甲基化水平越低。計(jì)算甲基化的CpG島含量，以百分比表示，結(jié)果如圖2所示，精子DNA作為陰性對(duì)照，甲基化CpG島的含量為5.0%，完全甲基化DNA作為陽性對(duì)照，含量為95.0%。在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，年輕細(xì)胞組含量為68.2%，中年細(xì)胞組有所降低，為41.9%，復(fù)制性衰老細(xì)胞組最低為16.1%，甲基化CpG島的含量呈下降趨勢(shì);對(duì)于處理組細(xì)胞，早衰起始組為63.5%，早衰持續(xù)組為18.0%，在細(xì)胞持續(xù)衰老的過程中，甲基化CpG島的含量也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。[3H]甲基摻入實(shí)驗(yàn)表明，與年輕細(xì)胞相比，衰老的細(xì)胞具有較低水平的基因組DNA甲基化CpG島含量。2.3dmnt1抗體對(duì)mna表達(dá)的影響通過RT-Q-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞甲基化相關(guān)酶的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，如圖3所示，在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，DNMT1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平以22PDL年輕細(xì)胞組的表達(dá)量為對(duì)照，設(shè)為1，其余各組的表達(dá)水平與之相比較，中年細(xì)胞組無明顯改變，復(fù)制性衰老細(xì)胞組降低75%，H2O2處理后，早衰起始組表達(dá)升高至1.84倍，而早衰持續(xù)組降低80%。應(yīng)用DNMT1抗體進(jìn)行蛋白印跡，其蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)具有相同的變化趨勢(shì)(圖4)。因此，在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，與年輕細(xì)胞相比，復(fù)制性衰老細(xì)胞組DNMT1明顯降低，對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰過程中，DNMT1表達(dá)呈下降趨勢(shì)，早衰組DNMT1的表達(dá)水平同復(fù)制性衰老組。3細(xì)胞復(fù)制性衰老及葉片dna甲基化水平變化基因組DNA的甲基化狀態(tài)是表觀遺傳調(diào)控模式的重要方面。DNA甲基化的升高和降低與衰老過程相聯(lián)系，甲基化的改變經(jīng)常以年齡相關(guān)的模式發(fā)生。在一些組織中，衰老細(xì)胞中甲基化的胞嘧啶水平降低，這種去甲基化狀態(tài)可以啟動(dòng)染色體的不平衡和重排，從而增加一些年齡相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過5-甲基胞嘧啶免疫熒光實(shí)驗(yàn)、[3H]甲基摻入實(shí)驗(yàn)分別定性和定量檢測(cè)細(xì)胞衰老過程中基因組DNA甲基化水平的變化情況。在人胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，基因組DNA甲基化整體趨勢(shì)逐漸下降，復(fù)制性衰老細(xì)胞組整體DNA甲基化水平最低;同樣，在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰過程中，基因組整體甲基化趨勢(shì)也是逐漸降低，早衰持續(xù)組基因組DNA甲基化水平最低，因此，基因組DNA甲基化水平的降低不僅與年齡有關(guān)，而且還受氧化應(yīng)激的影響，基因組DNA低甲基化狀態(tài)是衰老細(xì)胞的伴隨特征;基因組DNA的低甲基化與年齡、氧化應(yīng)激都有一定的關(guān)聯(lián)，而對(duì)甲基化水平的最終決定作用，取決于兩種因素作用于細(xì)胞的力量對(duì)比。然而，造成基因組DNA甲基化水平隨年齡改變的機(jī)制仍不清楚，DNMT1隨年齡表達(dá)降低，其可能作用于甲基化胞嘧啶內(nèi)容物的整體降低。有研究報(bào)道，應(yīng)用8-OH-鳥嘌呤取代鳥嘌呤，發(fā)現(xiàn)鄰近胞嘧啶的甲基化顯著改變，這一改變具有高度的位置特異性，氧自由基一定程度上改變所觀察的甲基化狀態(tài)。氧化劑能夠改變細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平，通過降低SAM的可利用度而影響DNA甲基化，而且也可以削弱細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)靶胞嘧啶甲基化的能力;單一的5-甲基胞嘧啶氧化成5-羥甲基胞嘧啶，能顯著抑制甲基化結(jié)合蛋白(Methy1-BindingDomainProtein,MBD)與寡核苷酸復(fù)合體的結(jié)合，從而降低結(jié)合能力。本研究又從甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化尋求基因組DNA甲基化水平改變的原因，在細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，DNMT1表達(dá)隨增齡呈下降趨勢(shì)。在WI-38成纖維細(xì)胞衰老過程中，DNMT1的mRNA表達(dá)水平降低，與本實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果一致。對(duì)于早衰起始組，H2O2處理4d之后，DNMT1表達(dá)升高，而隨著早衰程度的加