方劑辨治思維淺探

方劑辨治思維淺探

處方是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，處方的影響人體也是一個復(fù)雜的系統(tǒng)。要認(rèn)識雙重復(fù)雜系統(tǒng),須將復(fù)雜系統(tǒng)中非線性規(guī)律部分降解為線性規(guī)律去研究,多個線性規(guī)律的綜合有助于復(fù)雜系統(tǒng)的認(rèn)識,因此研究方劑應(yīng)遵循“復(fù)雜——簡單——復(fù)雜”的原則,發(fā)揮其自身的綜合優(yōu)勢,保持中藥原方的配伍特點,同時借鑒西藥的“分析”方法,通過有效組分的配伍配比規(guī)律研究,最終構(gòu)建藥效組分基本清楚、作用靶點及原理基本清楚、高效低毒的現(xiàn)代中藥。作為藥典方,復(fù)方丹參的生產(chǎn)廠家較多,且未形成合理的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),制劑呈現(xiàn)多樣性。同時各種劑型使用丹參和三七不同的有效組分,導(dǎo)致了臨床療效差異;而且丹參、三七、冰片不同組分在心肌缺血病理環(huán)節(jié)中各自的作用亦不明確,影響了復(fù)方丹參方的作用發(fā)揮。因此我們以復(fù)方丹參為基礎(chǔ)方,主要進(jìn)行了以下研究:一、以法統(tǒng)方,方法合合,聯(lián)合施藥,有序組合而成配伍配比是方劑的核心與靈魂,體現(xiàn)中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢,它既不是簡單的藥物作用在數(shù)量上的相加,也不是機械的毒副反應(yīng)的抵消,而是在辨證立法基礎(chǔ)上,以法統(tǒng)方,立方遣藥,有序組合而成的有制之師。1.對心血管的作用優(yōu)選丹參/三七最佳配比是本項研究的主要內(nèi)容。在進(jìn)行飲片(全成分)層次配伍研究的同時,為組分配伍研究提供技術(shù)平臺和方法學(xué)基礎(chǔ),為效應(yīng)明確的小復(fù)方的二次開發(fā)提供一種模式,同時為研制現(xiàn)代中藥提供科學(xué)依據(jù)。(1)在整體水平上。應(yīng)用犬冠狀動脈左前降支結(jié)扎法造成急性心肌缺血模型,并與血流動力學(xué)模型有機結(jié)合,著眼于全成分、整體動物、多效應(yīng)指標(biāo)動態(tài)觀察,建立了基線等比增減設(shè)計方法,對丹參/三七的不同比例:10/0、10/1、10/3、10/6、10/10、1/10、0/10進(jìn)行了多效應(yīng)比較藥效學(xué)研究。效應(yīng)評價指標(biāo)涉及到心外膜心電圖(∑-ST、N-ST)、心肌組織缺血區(qū)范圍、心肌生化標(biāo)志物(cTnI、CK-MB)、冠脈血流量、心肌耗氧量、血流動力學(xué)、一氧化氮、內(nèi)皮素、自由基等。結(jié)果表明:①以丹參為主的藥對比例組,即10/6、10/3、10/1、10/0,有明顯改善犬心肌缺血的作用,減輕由心外膜心電圖所標(biāo)測的心肌缺血程度,減少通過TTC染色所顯示的缺血區(qū)。②以丹參為主的藥對比例組對心肌鈣蛋白的增高有明顯的抑制作用,反映了丹參對心血管的直接作用強于三七。這與心外膜心電圖、心肌染色所反映的結(jié)果基本一致。③在對冠脈血流量有效增加的各組中,以丹參為主的藥組(10/0、10/3、10/6)作用較強。消心痛組在給藥后30min即發(fā)揮作用,但很快減弱;而中藥組(10/0、10/3、10/6)作用平穩(wěn)而持久、穩(wěn)中有升,遠(yuǎn)后效應(yīng)明顯。④10/6、10/3兩組可以明顯改善左室收縮及舒張功能,增加心輸出量及心臟指數(shù),減少血管總外周阻力,而左室做功沒有明顯增加,心率、平均動脈壓的波動較小。⑤0/10組(單純?nèi)?既促進(jìn)NO的釋放、保護SOD活性,又降低ET含量、減少MDA的產(chǎn)生,表現(xiàn)出較強的生物效應(yīng)。(2)在細(xì)胞水平上。應(yīng)用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)模型,對丹參、三七的上述7種比例進(jìn)行了研究,其指標(biāo)涉及到MTT、LDH、NO、ET等。結(jié)果表明:①在正常培養(yǎng)條件下,丹參可促進(jìn)增殖,三七反之,配比隨著丹參量的減少和三七量的加大增殖效果減弱;對于NO和ET均有降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。②在缺O(jiān)2損傷條件下,丹參促進(jìn)CMEC增殖,三七反之,配比在10/1～10/6范圍內(nèi),隨三七量加大,促進(jìn)CMEC增殖趨勢明顯。而在10/10～0/10范圍內(nèi),隨丹參量的減少,三七量的加大,CMEC增殖趨勢減弱,各配比組均可顯著降低NO釋放(除10/6P>0.05外,均P<0.01),且有降低ET分泌水平的趨勢,而尤以10/1和10/6效果最佳。2.各配比組不同配伍的療效分析丹參作為復(fù)方丹參方中的君藥,具有重要的藥理作用。丹參的主要水溶性物質(zhì)丹酚酸B、脂溶性提取物丹參酮ⅡA有各自的藥理活性,兩者配伍后有何藥效變化;針對不同的體外培養(yǎng)細(xì)胞:心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)、心肌細(xì)胞(CM)兩者又有何不同的作用重點;對于心臟的保護作用,兩者配伍后的最佳比例是多少,都是有待回答的問題。研究以丹酚酸B、丹參酮ⅡA為配伍,以缺氧、腫瘤壞死因子(TNF-α)為刺激因素,CMEC、CM為靶細(xì)胞,觀察不同配伍后的藥效變化并從中尋找二者作用的最佳比例和各自的作用靶點及機制。結(jié)果表明:①CMEC缺氧損傷時,各配比組均可提高CMEC活力,降低LDH釋放,丹酚酸B、丹參酮ⅡA配伍后的作用優(yōu)于單一藥物,且以2/8組最顯著;各配比組均有降低NO合成、ET釋放的趨勢。②CMEC被TNF-α損傷時,各配比組均可提高CMEC活力,降低LDH釋放,丹酚酸B與丹參酮ⅡA配伍后的作用強于單一藥物,且以5/5組為最佳;各配比組均有增加SOD活性,減少MDA產(chǎn)量的趨勢,丹參酮ⅡA抗氧化損傷的能力最強。丹參酮ⅡA提高NO合成、減少ET的釋放的作用最顯著。③CM缺氧損傷時,各配比組對CM增殖的作用不明顯,但丹酚酸B的作用強于丹參酮ⅡA;丹酚酸B、丹參酮IA配伍后減少LDH釋放、NO合成的作用強于兩者單獨使用,且以5/5的比例為最佳。④CM被TNF-α損傷時,各配比組均能明顯減輕細(xì)胞的損傷程度,表現(xiàn)在細(xì)胞活力增強,LDH釋放的減少,保護作用以8/2組最佳,5/5組次之;各配比組均有升高SOD,減少MDA的作用,丹參酮ⅡA減少MDA的作用最強。二、臨床治療機制的研究少,缺少有效的機理復(fù)方丹參治療心肌缺血的機制,一般認(rèn)為其有擴冠、降低心肌耗氧量、抗血小板聚集等作用,但目前的研究還不足以揭示臨床治療機制,其深層次的機理研究更少。已知其抗心肌缺血的機理不同于硝酸酯類化合物的釋放外源性一氧化氮使冠脈擴張,但其通過何種途經(jīng)發(fā)揮對缺血心肌的保護作用,其整合調(diào)節(jié)如何體現(xiàn),值得深入探討。1.復(fù)方有效預(yù)防心律失常1986年Murry提出心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IschemicPreconditioning,IPC)現(xiàn)象為心肌細(xì)胞保護及機理探討開辟了新領(lǐng)域,20世紀(jì)90年代受到廣泛重視,并開展了藥物預(yù)適應(yīng)研究。多數(shù)中藥發(fā)揮作用的途徑不同于西藥的直接對抗和補充,而在于整合調(diào)節(jié)。復(fù)方丹參方治療心肌缺血是否因其激活內(nèi)源性保護物質(zhì)而發(fā)揮作用,尚不知曉。采用大鼠在體預(yù)適應(yīng)模型,觀察了復(fù)方丹參方模擬和加強缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護作用及機制。結(jié)果表明:再灌組、早晚期假性預(yù)適應(yīng)組壞死重量占缺血重量(IS/AAR)分別高達(dá)45%、47%、45%;心律失常發(fā)生率也分別高達(dá)76.46%、55.56%、73.33%;血清中LDH含量也顯著高于對照組,P<0.01。缺血預(yù)處理后,IPC早期組IS/AAR與早期假性預(yù)適應(yīng)組相比降低了17%,晚期IPC組IS/AAR與晚期假性預(yù)適應(yīng)組相比僅降低4%;早期IPC和晚期IPC組心律失常發(fā)生率分別為11.76%、43.75%,顯著低于再灌和早晚期假性預(yù)適應(yīng)組,P<0.01;IPC后LDH釋放也減少。說明缺血預(yù)適應(yīng)可縮小缺血范圍,減少心律失常的發(fā)生率。復(fù)方丹參方預(yù)處理后,在再灌、IPC基礎(chǔ)上IS/AAR進(jìn)一步縮小約10%-17%,LDH釋放也減少,LDH含量以藥物+晚期IPC組最低,與晚期假性預(yù)適應(yīng)組相比,P<0.05,但復(fù)方丹參方對心律失常的影響不明顯。另外復(fù)方丹參方預(yù)處理后,還可使血清中MDA下降,SOD活性增強。通過免疫組化和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方丹參預(yù)處理后可以使早、晚期IPC組和再灌組的心肌細(xì)胞iNOS、PKCmRNA和蛋白表達(dá)明顯加強,p<0.05,對再灌HSP70表達(dá)也有增加趨勢。2.丹酚酸b預(yù)適應(yīng)抗菌劑的作用機制丹參水溶性成分系統(tǒng)研究表明:丹參含多種酚酸類化合物,其中丹酚酸B的含量最高,因此,我們在CMEC和CM培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)上,基于缺氧預(yù)適應(yīng)(HPC)機制,建立缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷的細(xì)胞模型,以細(xì)胞活力(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、內(nèi)皮素(ET)等生化指標(biāo)及超微結(jié)構(gòu)變化為評價標(biāo)準(zhǔn),觀察了丹酚酸B預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞保護效應(yīng);并采用以蛋白激酶C(PKC)抑制劑chelery-thrine、KATP通道阻滯劑優(yōu)降糖為工具藥的方式,在對內(nèi)源性保護物質(zhì)PKC、熱休克蛋白70(HSP70)的mRNA表達(dá)影響上,探討了丹酚酸B預(yù)處理細(xì)胞保護的分子生物學(xué)機制。結(jié)果表明:①在正常培養(yǎng)條件下,丹酚酸B可明顯提高CMEC和心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和SOD活性、降低LDH活性、維持正常的形態(tài)超微結(jié)構(gòu),有降低CMEC的ET分泌和NO釋放趨勢。②缺O(jiān)2預(yù)適應(yīng)可增強細(xì)胞對隨后較長時間缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷的耐受性,表現(xiàn)為可提高細(xì)胞存活率和SOD活性,降低LDH活性,而且能明顯降低CMEC因缺O(jiān)2/復(fù)O2導(dǎo)致的ET和NO水平升高,同時明顯改善其形態(tài)超微結(jié)構(gòu)變化。③丹酚酸B預(yù)適應(yīng)具有與缺O(jiān)2預(yù)適應(yīng)相似的細(xì)胞保護效應(yīng),對于CMEC表現(xiàn)為早期保護和延遲保護兩個時相。④KATP通道阻滯劑優(yōu)降糖不能消除HPC的CMEC保護作用,選擇性PKC抑制劑cheler-ythrine消除了HPC的CMEC保護效應(yīng),丹酚酸B預(yù)適應(yīng)可以使CMEC被PKC抑制劑阻斷的HPC效應(yīng)重現(xiàn)。⑤在早期預(yù)適應(yīng)中,丹酚酸B預(yù)適應(yīng)可促進(jìn)缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷CMEC的HSP70mRNA、PKCmRNA表達(dá)增強,且明顯優(yōu)于HPC;在晚期預(yù)適應(yīng)中,丹酚酸B預(yù)適應(yīng)同樣促使HSP70mRNA表達(dá)增強,且與HPC具有疊加效應(yīng)。三、復(fù)方參方成分含量及穩(wěn)定性的測定及其比較方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不是單一成分,而是復(fù)雜的混合物,因此必須結(jié)合藥理學(xué)對方劑藥效物質(zhì)降解分析,進(jìn)行有效組分和有效成分的化學(xué)篩選,建立規(guī)范的提取方法,進(jìn)行有效成分的指紋圖譜識別和指標(biāo)成分的定量分析,在主要藥效學(xué)導(dǎo)向下,制定藥材和方劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。選擇復(fù)方丹參方中的10個成分作為指標(biāo):丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1,采用高效液相色譜法對給藥前后復(fù)方丹參方中丹參水溶性成分、脂溶性成分及三七皂苷類成分進(jìn)行含量測定。根據(jù)這些成分理化性質(zhì)間的差異,建立了色譜條件。對丹參、三七各配比(生藥量之比:10/0、10/1、10/3、10/6、10/10、1/10、0/10)組方中主要成分的含量及穩(wěn)定性進(jìn)行測定和考察。在此基礎(chǔ)上還對大鼠灌服復(fù)方丹參方后血清中的丹參素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行檢測和藥物動力學(xué)研究。主要結(jié)論:1.復(fù)方丹參方不僅具有抗心肌缺血的作用,而且有增強缺血預(yù)適應(yīng)效果作用機制可能是擴冠和激活內(nèi)源性保護物質(zhì)的釋放。2.丹參的作用靶點側(cè)重于血管,其擴張冠脈的效應(yīng)強于三七三七的作用靶點側(cè)重于心肌,其對缺氧心肌的保護作用強于丹參;3.結(jié)合化學(xué)結(jié)果分析得出:二者配伍后存在協(xié)同互補效應(yīng),三七皂苷類成分可使丹參水溶、脂溶成分的含量穩(wěn)定丹參水溶性成分吸收入血較快(給藥后30min),擴冠效應(yīng)強,更適于速效;而丹參脂溶性成分和三七皂苷類成分吸引入血較慢(給藥后60min),遠(yuǎn)后效應(yīng)明顯,更適宜長效。4.丹酚酸B與丹參酮IIA均有抗心肌缺血的作用,但各有側(cè)重5.復(fù)方丹參方中丹參的水溶性成分以丹酚酸B含量為最高,其次是丹參素、原兒茶醛;丹參脂溶性成分的含量高低依次為隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ;三七皂苷類成分則以人參皂苷Rg1含量為最高,其次是人參皂苷Rbl、三七皂苷R1,再次為人參皂苷Re。6.復(fù)方丹參方中各類成分的穩(wěn)定性是三七皂苷類成分強于丹參水溶性成分,而水溶性成分的穩(wěn)定性又優(yōu)于脂溶性成分復(fù)方丹參方配比不同時,同類成分間的穩(wěn)定性有所差異,其穩(wěn)定性隨著三七在處方中所占比例的增大而呈增強的趨勢,說明復(fù)方丹參方中各主