結(jié)核病小鼠肺部病理變化與細(xì)胞亞群的關(guān)系

結(jié)核病小鼠肺部病理變化與細(xì)胞亞群的關(guān)系

在過(guò)去10年中，全球衛(wèi)生發(fā)病率顯著增加。經(jīng)世界衛(wèi)生組織調(diào)查,全球約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌。盡管卡介苗的普遍應(yīng)用和藥物治療有效性的不斷提高,結(jié)核病仍然是全世界范圍內(nèi)最普遍的傳染性疾病之一。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,結(jié)核病人數(shù)僅次于印度而居世界第二位。人類雖然對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染率很高,但發(fā)病率卻較低,攜菌人群比例較高。母牛分枝桿菌菌苗(微卡菌苗)系母牛分枝桿菌加熱滅活制劑,對(duì)人不致病,能增強(qiáng)免疫力,艾滋病等免疫缺陷者和各類人群均可使用,不引起菌血癥和變態(tài)反應(yīng),能用于成人結(jié)核病的免疫預(yù)防,但該菌苗在活動(dòng)性結(jié)核病中所起作用尚且不知,尤其對(duì)CD4+、γδT細(xì)胞亞群作用不清楚。本文擬用人型結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒力株(H37RV)建立小鼠結(jié)核病模型,觀察小鼠肺組織病理變化,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微卡菌苗治療結(jié)核病模型小鼠前后外周血T細(xì)胞亞群變化,以探討結(jié)核病感染中肺組織損傷程度與T細(xì)胞亞群變化的相關(guān)性,以及為微卡菌苗用于臨床治療結(jié)核病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1微生物和抗鼠動(dòng)物:健康雄性C57BL小鼠,4～6周齡,體重18～22g,SPF級(jí)。購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,飼養(yǎng)于安徽龍科馬生物制藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物室。H37RV標(biāo)準(zhǔn)毒力株:由安徽省龍科馬生物制藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,毒力指數(shù)為60。按常規(guī)接種于羅氏雞蛋培養(yǎng)基上,37℃斜面培養(yǎng)3～4周。微卡菌苗:由安徽省龍科馬生物制藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)?？贵w:抗鼠CD3、CD4、CD8和γδT細(xì)胞單克隆抗體,購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀:FACSCalibnr,BD公司。1.2方法1.2.1小鼠分枝桿菌的制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組:結(jié)核病模型組,免疫調(diào)節(jié)劑組,正常對(duì)照組,每組20只。結(jié)核病小鼠模型的建立:取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的結(jié)核分枝桿菌(H37RV)的培養(yǎng)物,經(jīng)磨菌管充分研磨成勻漿后用生理鹽水稀釋,配制成7mg/ml(1×106CFU)的菌體混懸液,每只小鼠經(jīng)球后靜脈叢注射0.05ml。免疫調(diào)節(jié)劑組:按結(jié)核感染組同樣劑量和方法復(fù)制小鼠結(jié)核病模型,然后在感染后第3、10、17天,分別于每只小鼠的股部肌肉注射微卡菌苗22.5μg(溶于1ml生理鹽水中,每側(cè)肌注0.5ml)。1.2.2小鼠需要免疫調(diào)節(jié)劑治療結(jié)核病模型組小鼠于感染后4周,每只小鼠采用摘除眼球法取外周血0.3～0.5ml,保存于肝素抗凝的Eppendorf管中室溫保存,免疫調(diào)節(jié)劑組和正常對(duì)照組小鼠同期同方法處理。用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定外周血CD3+、CD4+、CD8+、γδT細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量,結(jié)果以百分比表示。1.2.3中性甲醛中蘇葉紅染色取血后小鼠脫頸處死,取出肺臟立即放入10%中性甲醛中固定,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片,厚4μm,分別做蘇木精-伊紅染色(HE)及抗酸染色。1.3統(tǒng)計(jì)處理不同組小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、γδT細(xì)胞相對(duì)數(shù)值(百分比)均以表示,采用方差分析進(jìn)行比較。2結(jié)果2.1小肺組織病理學(xué)改變2.1.1大量炎性細(xì)胞浸漬感染4周后,結(jié)核病模型組大部分肺組織實(shí)變,多數(shù)肺泡腔消失,肺泡隔重度增寬,肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),浸潤(rùn)細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主,淋巴細(xì)胞較少。殘存的肺泡腔中有紅細(xì)胞、纖維素滲出(見(jiàn)圖1A)。免疫調(diào)節(jié)劑組肺組織病變和結(jié)核病模型組大致相似,但實(shí)變病灶較少,多數(shù)肺泡腔存在,肺泡隔內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞較多,肺泡腔內(nèi)有滲出單核-巨噬細(xì)胞(見(jiàn)圖1B)。2.1.2分枝桿菌細(xì)胞感染4周后,結(jié)核病模型組肺實(shí)變區(qū)內(nèi)分布大量的紫紅色結(jié)核分枝桿菌,主要存在于單核-巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),肺泡實(shí)變區(qū)內(nèi)變性壞死的中性粒細(xì)胞較多(見(jiàn)圖1C)。免疫調(diào)節(jié)劑組肺實(shí)變區(qū)內(nèi)結(jié)核分枝桿菌明顯少于結(jié)核病模型組(見(jiàn)圖1D)。2.2降低0.0pp感染4周后,結(jié)核病模型組CD3+、CD4+、CD8+和γδT細(xì)胞比例均較正常對(duì)照組降低(P<0.05～P<0.01)。與結(jié)核病模型組比較,免疫調(diào)節(jié)劑組均能增加CD3+、CD4+和γδT細(xì)胞比例(P<0.05～P<0.01),而CD8+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值均未伴隨用藥出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)(見(jiàn)表1)。3免疫調(diào)節(jié)劑的作用結(jié)核病是結(jié)核桿菌引起的傳染性疾病,在其病程中,引起T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,細(xì)胞介導(dǎo)免疫是機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌的主要防御機(jī)制。結(jié)核病的免疫主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫,對(duì)結(jié)核病的發(fā)病和演變具有決定性意義,尤其是CD4+、CD8+、γδT細(xì)胞的數(shù)量和功能與結(jié)核病的病情進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。李柏青等研究資料表明肺結(jié)核患者處于免疫低下?tīng)顟B(tài),CD4+T細(xì)胞和γδT細(xì)胞均參與機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性機(jī)制。CD4+T細(xì)胞在激活、趨化巨噬細(xì)胞,促進(jìn)巨噬細(xì)胞完全殺滅結(jié)核分枝桿菌等方面起著重要的作用。肺結(jié)核患者外周血的CD4+T細(xì)胞的水平明顯低于健康人,CD4+T細(xì)胞有隨疾病嚴(yán)重而降低的趨勢(shì),表明CD4+T細(xì)胞在結(jié)核病免疫防御機(jī)制中占有重要地位,CD4+T細(xì)胞的降低可能是結(jié)核病惡化的原因之一。CD8+T細(xì)胞在結(jié)核病中的免疫作用觀點(diǎn)不一,有研究者認(rèn)為,結(jié)核病治療失敗或復(fù)發(fā)的關(guān)鍵是由于被結(jié)核分枝桿菌感染的靶細(xì)胞的存在,CD8+T細(xì)胞數(shù)過(guò)少或是CD4+和CD8+雙受體開放的T細(xì)胞數(shù)量不足,就無(wú)法清除靶細(xì)胞及其所保護(hù)的結(jié)核分枝桿菌。CD8+T細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫,發(fā)揮細(xì)胞毒作用,溶解受感染后失去了免疫活性的靶細(xì)胞或使之凋亡,促使結(jié)核菌暴露及病灶清除等方面有重要的作用。γδT細(xì)胞是針對(duì)結(jié)核桿菌感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答中另一主要的T細(xì)胞亞群,分枝桿菌抗原可激活γδT細(xì)胞在入侵的局部聚集、增殖,從而消滅這些病原菌。γδT細(xì)胞的活化和增殖,參與抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答。結(jié)核病治療以化療為主,但是常規(guī)化療并不能直接糾正已經(jīng)啟動(dòng)的異常免疫應(yīng)答,而且近年來(lái),由于耐藥菌株的增多,單純化療難以達(dá)到理想的治療目的。國(guó)內(nèi)外研究者在結(jié)核化療的同時(shí),已開展結(jié)核病免疫治療方面的研究。潘家華等研究卡介苗配用腺苷接種可提高巨噬細(xì)胞抗結(jié)核桿菌的效能。微卡菌苗是含有與結(jié)核分枝桿菌相似的共同抗原,是雙相免疫調(diào)節(jié)劑,能使對(duì)機(jī)體起損害作用的超敏反應(yīng)減弱,也能使低落的保護(hù)性免疫反應(yīng)增強(qiáng)。莊玉輝等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微卡菌苗對(duì)于T淋巴細(xì)胞反應(yīng)有明顯促進(jìn)作用,使機(jī)體殺滅結(jié)核分枝桿菌作用明顯增強(qiáng)。周峰等聯(lián)用微卡菌苗治療淋巴結(jié)結(jié)核,一方面能增強(qiáng)機(jī)體免疫力,另一方面能降低機(jī)體敏感性,抑制上述過(guò)強(qiáng)的變態(tài)反應(yīng),減輕病理?yè)p害。治療組在病理治愈方面優(yōu)于對(duì)照組。嚴(yán)重感染患者治療過(guò)程中出現(xiàn)暫時(shí)性惡化情況,治療組少于對(duì)照組(P<0.01),說(shuō)明微卡菌苗起到了抑制降低機(jī)體的變態(tài)反應(yīng)(過(guò)敏反應(yīng))的作用。我們的研究結(jié)果表明,結(jié)核病模型組小鼠的肺部病變主要以肺泡間質(zhì)、支氣管周圍炎及肺泡腔內(nèi)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征,缺乏浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果顯示CD3+、CD4+、CD8+和γδT細(xì)胞的相對(duì)比例均降低(P<0.05～P<0.01)。表明T細(xì)胞免疫功能受到抑制。故抗結(jié)核菌能力弱,肺實(shí)變區(qū)內(nèi)見(jiàn)密集結(jié)核分枝桿菌分布,大量浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致肺組織嚴(yán)重?fù)p傷。免疫調(diào)節(jié)劑組與結(jié)核病模型組比較,外周血CD3+、CD4+和γδT細(xì)胞比例均呈現(xiàn)升高,γδT細(xì)胞在抗感染中起著保護(hù)組織不受損傷的作用,故肺部病變范圍和程度明顯減輕,分枝桿菌感染細(xì)胞明顯減少。從實(shí)驗(yàn)我們可以看出結(jié)核病動(dòng)物模型中肺病理改變和細(xì)胞免疫具有相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明,微卡菌苗可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。并且能減輕肺部病變,促進(jìn)肺部病變的吸收,有利于機(jī)體的恢復(fù)。但是免疫調(diào)節(jié)劑組CD8+T細(xì)胞和CD4+/C