黃酒發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)變化

黃酒發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)變化

氨基丙烯酸（ce，也稱為urethan）是一種遺傳癌。世界衛(wèi)生組織也提議規(guī)定酒類飲料中EC的限量標準。美國和加拿大都已經(jīng)制訂了酒精飲料中氨基甲酸乙酯的限量標準。在氨基甲酸乙酯的形成過程中,瓜氨酸是其重要的前體物質(zhì),而在乳酸菌和酵母菌中精氨酸的代謝過程中都有瓜氨酸的產(chǎn)生。酵母降解精氨酸是通過尿素循環(huán)途徑實現(xiàn)的,反應(yīng)見圖1。乳酸菌降解精氨酸是通過精氨酸脫亞氨基酶途徑(Argininedeiminasepathway,簡稱ADI途徑)進行。本實驗通過對黃酒發(fā)酵過程中3種氨基酸的檢測,研究了黃酒發(fā)酵過程中3種氨基酸的變化規(guī)律,為控制黃酒發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯含量提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1水、電、優(yōu)、腦菌株:麥曲和酒母取自下沙黃酒廠。試劑:精氨酸,瓜氨酸,鳥氨酸,乙酸,α-萘酚,2,3-丁二酮,NaOH,磷酸,二乙酰一肟,茚三酮,均為國產(chǎn)分析純;水為桶裝純凈水。儀器設(shè)備:Boxun潔凈工作臺,上海;精宏恒溫培養(yǎng)箱,上海;精宏恒溫水浴鍋,上海;志威恒溫磁力攪拌器,上海;721可見分光光度計,上海;SL-N電子天平,上海;不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋,上海。1.2測試方法1.2.1發(fā)酵參數(shù)的測定活菌計數(shù)采用平板計數(shù)法,平行實驗2次,取平均值。發(fā)酵參數(shù)參考自下沙黃酒廠。氨基酸測定方法:精氨酸的測定參照賀小賢等的方法;瓜氨酸的測定參照李加友等的方法;鳥氨酸的測定參照黃愛清等的方法。1.2.2瓜氨酸標準曲線精氨酸標準曲線繪制:在精氨酸含量為0~200μg/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=0.024+0.005×X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.995。瓜氨酸標準曲線繪制:在瓜氨酸含量為0~200μg/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=-0.05+0.0075×X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.997。鳥氨酸標準曲線繪制:在鳥氨酸含量為0~150μg/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=8×10-5+0.00959×X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.999。2結(jié)果與分析2.1糖化階段酵母菌和酒化過程中的氨基酸濃度變化先加入酒母后加入麥曲,考察氨基酸和酵母菌濃度的變化情況。將200g大米浸泡18h,添加適量的水,蒸煮30min后加入10g酒母,置于30℃恒溫箱,每隔12h測試1次,3d后加入麥曲20g,繼續(xù)發(fā)酵至7d時即發(fā)酵結(jié)束。由表1可知,本過程可以分為2個階段,0~72h為酒化階段,此階段先加入了酵母菌進行酒化。由酵母菌濃度數(shù)據(jù)分析可知0~24h為延遲期,此后為指數(shù)期。在72h時,加入麥曲,從而進入了糖化階段。由于該過程加入了較多的水,并且麥曲中的微生物對酵母菌有競爭作用,因此,在糖化的初始階段,酵母菌濃度略微下降,隨后又開始增長,在120h后,由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,酵母菌濃度逐漸降低。因為麥曲中微生物群的競爭作用,糖化階段酵母菌的濃度比酒化階段要低。對發(fā)酵過程各氨基酸濃度變化情況進行分析,結(jié)果見圖2~圖4。由圖2~圖4可知,精氨酸濃度在酒化階段一直是增長的,在進入指數(shù)期后增長速度較快。瓜氨酸的濃度則在最初迅速增長到達較大的濃度,隨后出現(xiàn)了降低;鳥氨酸濃度的變化和精氨酸類似,在進入指數(shù)期后濃度開始較快增長。在糖化階段,精氨酸的濃度先出現(xiàn)了降低,這與加入了大量的水降低了精氨酸的相對濃度有關(guān),隨后開始逐漸上升,在120h時達到了峰值,此時也是酵母菌穩(wěn)定期的最后階段,隨后精氨酸濃度隨著菌落的衰亡期逐漸下降。在酒化階段的末尾,瓜氨酸的濃度已經(jīng)開始降低,隨后在加入麥曲后,瓜氨酸濃度又開始升高,但值得注意的是,在140h時,瓜氨酸濃度突然降低,隨后又升高。由于麥曲中的微生物數(shù)目較多,尚不清楚其代謝機理,有待進一步研究。2.2麥曲和酒母發(fā)酵過程中精氨酸的濃度變化同時加入酒母和麥曲,觀察氨基酸和酵母菌濃度的變化情況。取200g大米,浸米18h,然后適量加水蒸煮30min,待冷卻后,同時加入酒母10g,麥曲27g,涼開水300g,發(fā)酵,每12h測試1次氨基酸的含量并進行活菌計數(shù)。酵母菌濃度變化結(jié)果見表2;各氨基酸濃度變化結(jié)果見圖5~圖7。由表2可以看出,由于同時加入麥曲和酒母,微生物間競爭比較激烈,導(dǎo)致酵母菌濃度比試驗2.1中的要低。由于同時加入了酒母和麥曲,微生物生長較快,對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗比較快,因此,與試驗2.1相比,縮短了發(fā)酵的時間,為84h。由圖5~圖7可知,精氨酸在初始階段,有較少的生成量,但是隨后開始迅速下降,在36h時甚至降為零,然后又開始緩慢上升,但其濃度依然比試驗2.1中要低。在初始階段,瓜氨酸濃度較快升高,24h達到頂峰,隨后開始下降到5μg/L,并且在隨后的發(fā)酵過程中波動較小。在同時加入麥曲和酒母進行發(fā)酵的條件下,精氨酸的初期濃度相對于試驗2.1要低得多,并且在36h時,幾乎降為零,隨后又開始緩慢上升。由此表明,麥曲菌落群對于精氨酸具有較大的消耗作用,在前期,精氨酸的濃度要比試驗2.1中低得多。直到發(fā)酵后期,精氨酸的濃度才開始逐漸升高。而瓜氨酸濃度則在初期迅速升高,在24h達到最高值,隨后開始降低,在2d后其濃度變化趨于平緩。鳥氨酸濃度則一直處于上升趨勢中,且在發(fā)酵初期就達到了比較高的水平。2.3酵母菌群的發(fā)酵先加入麥曲后加入酒母,觀察氨基酸和酵母菌濃度的變化情況。稱取200g大米,先浸米18h,然后適量加水蒸煮30min,先加入麥曲20g及300g涼開水進行糖化,每隔12h測試1次并進行活菌計數(shù),在48h后加入酵母,繼續(xù)測試至結(jié)束。酵母菌濃度變化結(jié)果見表3,各氨基酸濃度的變化見圖8~圖10。由表3結(jié)果所示,先加入麥曲,0~36h屬于糖化階段,于36h時加入酵母,進入酒化階段。從菌落濃度對比可以看出,先加入麥曲,麥曲菌群的生長對于酵母菌的發(fā)育具有一定抑制作用,加入酵母菌后,其最高濃度也不過是4.8×106個/mL。不但比試驗4中的菌落濃度低,比試驗5中的也要低很多。可以判斷,麥曲菌群與酵母菌群是競爭關(guān)系,尤其是在先進行糖化作用時,麥曲菌群一方面迅速繁殖,另一方面會大量消耗營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致加入酵母菌后,其濃度降低。圖8~圖10顯示,精氨酸的絕對濃度比試驗2.1中的要低許多,可見糖化作用中精氨酸的消耗比較大。在糖化的后半階段,甚至出現(xiàn)了精氨酸濃度幾乎為零的情況。在36h加入酵母后,精氨酸濃度迅速升高,并在60h時達到峰值。但是濃度也只有19.2μg/L,遠低于試驗2.1和試驗2.2中精氨酸濃度的峰值。在糖化階段,瓜氨酸濃度穩(wěn)步上升,可以判斷,在糖化階段會較穩(wěn)定的積累瓜氨酸。而在加入酒母后,瓜氨酸濃度反而開始有所下降,在60h后有所回升。與圖3、圖6相比,糖化階段的瓜氨酸積累速度都要更快,而其峰值濃度則差不多。可以印證,麥曲微生物群的活力比酵母菌要強,這幾種氨基酸的消耗和積累速度都要比酒化階段快。在糖化階段,鳥氨酸濃度迅速達到較高值,但在12~24h階段,卻略有下降,在24h時即穩(wěn)步上升,即使加入酒母后,其上升趨勢依舊穩(wěn)定,與圖7對比可知,酒化階段和糖化階段都有鳥氨酸的持續(xù)積累。結(jié)合圖2分析,在酵母菌的尿素循環(huán)途徑中,精氨酸被轉(zhuǎn)化為鳥氨酸。在圖7中,36h前,精氨酸濃度迅速下降,表明在糖化階段的初始階段,麥曲微生物群要消耗大量的精氨酸,而與之對應(yīng)的是鳥氨酸濃度升高很快,推測是精氨酸轉(zhuǎn)化成了鳥氨酸。在36h,精氨酸濃度開始升高,鳥氨酸濃度也迅速增高。此時酵母菌菌群的代謝開始顯現(xiàn)。在48~60h階段,瓜氨酸的含量有一個較為明顯的下降,由酵母的尿素循環(huán)途徑可知瓜氨酸的代謝與代謝過程(2)、(3)、(5)都有關(guān),牽涉反應(yīng)較多,其具體積累機理還需要進一步的研究。而代謝過程(2)、(5)是互相競爭的,在生產(chǎn)中可以減少發(fā)酵過程中氨氣的積累,促進代謝過程(5)的進行,從而抑制鳥氨酸的產(chǎn)生,并抑制瓜氨酸的積累。3糖化過程中瓜氨酸的代謝黃酒生產(chǎn)首先要將大米中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖,然后才能發(fā)酵,所以工藝一般為先糖化后酒化或糖化酒化同時進行。但是本實驗所取下沙黃酒廠的工藝是采用了先酒化后糖化的方法,其麥曲活性比較高,利用此方法避免了先糖化對于營養(yǎng)物質(zhì)的迅速消耗,并且保證了出酒率。3種發(fā)酵方法相比較,以試驗2.1中釀造酒醅質(zhì)量最佳。試驗2.2和試驗2.3中,由于在糖化階段麥曲菌群的代謝迅速,營養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗,會影響出酒率,且容易發(fā)生酸化現(xiàn)象。酒化階段,本試驗所得數(shù)據(jù)與酵母的尿素循環(huán)途徑可以較好的印證。糖化階段初始會有精氨酸的迅速消耗。瓜氨酸變化較為復(fù)雜,但是亦有相當?shù)姆e累。鳥氨酸濃度則一直升高,推測是精氨酸轉(zhuǎn)化成了鳥氨酸。在之前的研究中,大多關(guān)注酒化過程和酸化過程中瓜氨酸的積累,而對于麥曲糖化過程中瓜氨酸的代謝尚缺乏詳細研究。本實驗證明,在麥曲的糖化過程中,也有瓜氨酸的積累。要控制黃酒生產(chǎn)過程中氨基甲酸乙酯含量,需要同樣考慮到糖化階段的影響。采用加酵母后加