啤酒酵母多糖的提取和水解研究

啤酒酵母多糖的提取和水解研究

氨基乙醇醇酸具有增強(qiáng)mcclovac細(xì)胞活性、提高硬度、腫瘤和抗癌的功效。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、護(hù)理和食品等行業(yè)。有研究認(rèn)為,酵母細(xì)胞壁中存在的β-1,6-分支的堿不溶性和堿溶性β-1,3-D-葡聚糖、中間插有β-1,3-鍵的無定型的酸溶性β-1,6-D-葡聚糖、多糖類化合物是啤酒酵母中主要的活性成分之一。目前研究證實(shí),多種免疫細(xì)胞表面具有能與葡聚糖結(jié)合或?qū)ζ渥鞒龇磻?yīng)的接收器,酵母多糖可對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生積極的功效。目前,僅歐洲生產(chǎn)酵母水溶性葡聚糖,國(guó)內(nèi)以安琪酵母為代表的葡聚糖產(chǎn)品均為水不溶葡聚糖。為了獲得可溶性酵母葡聚糖,本實(shí)驗(yàn)采取不同的提取方法,對(duì)啤酒酵母多糖進(jìn)行提取和水解,并對(duì)獲得的酵母多糖組分進(jìn)行分析。1材料和方法1.1酵母葡聚糖的制備購自上海杰康諾科技有限公司,為黃棕色粉末,具有酵母特有的香味,水分≤8.0%,灰分≤9.0%,粗蛋白≥42%,粗脂肪≤1.5%,葡聚糖為20%~40%。1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器葡聚糖(Dextran系列,相對(duì)分子質(zhì)量約43000,來源于明串珠菌屬的腸膜明串珠)和Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑[為一種天然高分子化合物,由A、B兩組分組成,配制方法:A組分溶液:用少量去離子水(蒸餾水)將A組分(白色至微黃色粉末)攪拌成糊狀,加入蒸餾水,溶脹24h,攪拌,用雙層紗布過濾,即得1%(g/ml)黏膠液;B組分溶液:用少量1%醋酸溶解B組分(微黃色至淺黃色粉末)并攪成糊狀,加入1%醋酸,溶脹24h,攪拌,用雙層紗布過濾,即得1%(g/ml)黏膠液]均購自天津振天成科技有限公司;ViscozymeL酶制劑購自丹麥諾維信公司;葡萄糖、甘露糖、硫酸、苯酚、乙醇、氫氧化鈉、醋酸等試劑均為分析純;Agilent1100高效液相色譜儀和蒸發(fā)光檢測(cè)器購自安捷倫公司;WatersSugerpark-1(6.5mm×300mm)色譜柱購自沃特世公司;中空纖維微、超濾設(shè)備購自天津膜天膜設(shè)備有限公司;FD-ID-55真空冷凍干燥器購自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;WPG-220A小型噴霧干燥機(jī)購自山東奧諾能源科技有限公司;UV-1700紫外可見分光光度計(jì)購自島津儀器(蘇州)有限公司。1.5總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的含量,并按下式計(jì)算多糖的收率。式中DT為所提取多糖的總糖含量;200為稱取的酵母細(xì)胞壁的量(g)。1.6測(cè)定蛋白質(zhì)含量的測(cè)定1.7氟乙酸水解tfa參照張開誠(chéng)和Silke等的方法進(jìn)行。取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、單糖葡萄糖、甘露糖、DT1、DT2、DT3各30mg,經(jīng)5ml2mol/L三氟乙酸(trifluoroaceticacid,TFA)110℃封管水解,分別于水解后3、6、9、12h時(shí)取出,冷卻至50℃以下,用甲醇蒸除TFA,至pH試紙顯色達(dá)5以上。1.8高效液相色譜法檢測(cè)在標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(平均相對(duì)分子質(zhì)量約430000)、不同種類的酵母多糖、葡萄糖和甘露糖單糖各15mg的水解物中加入2ml蒸餾水,振蕩搖勻后,過0.45μm水系膜,進(jìn)行液相檢測(cè),分別以5mg/ml葡萄糖、甘露糖、葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。色譜條件:儀器:高效液相色譜儀;檢測(cè)器:蒸發(fā)光檢測(cè)器(45℃);色譜柱:WatersSugerpark-1(6.5mm×300mm);流動(dòng)相:雙蒸水;流速:0.6ml/min;柱溫:80℃;進(jìn)樣體積:2μl。2結(jié)果2.1多糖含量的測(cè)定獲得的3種酵母多糖成分DT1、DT2、DT3的總糖含量分別為94.61%、95.89%、94.56%,收率分別為9.3%、3.6%、23.4%,各多糖的蛋白含量分別為2.98%、1.89%、3.34%。2.2分析多羅水的成就2.2.1酵母多糖的定性分析甘露糖、葡萄糖、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間分別為8.877、7.859和3.954min,見圖1。表明所采用的色譜條件可將葡萄糖與甘露糖完全分離,定性分析酵母多糖的成分;另外,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品中含2%左右的雜質(zhì),可能是葡萄糖自身不純帶來的。2.2.2水解前多糖峰的判別在TFA濃度為2mol/L,水解溫度為110℃的條件下,標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖水解3和12h,雜峰很多,在3.954min附近時(shí),出現(xiàn)1個(gè)峰,推斷為未水解的多糖峰和雜質(zhì)峰,水解3、6、9、12h時(shí),此處的多糖峰面積分別為12%、5%、17%和8%;在7.895min附近時(shí),出現(xiàn)1個(gè)葡萄糖峰,水解3、6、9、12h時(shí),此處的葡萄糖峰面積分別為88%、95%、83%和92%。表明標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖水解6h水解效果最好,無雜峰出現(xiàn),水解率可達(dá)95%。見圖2。2.2.3不同峰段的雜質(zhì)峰和保留程度對(duì)比葡萄糖和甘露糖在TFA濃度為2mol/L,水解溫度為110℃的條件下水解6和12h,保留程度基本一致,在7.86和8.87min處均出現(xiàn)峰面積為46%的峰,在3.95min處,均出現(xiàn)峰面積為7%的雜質(zhì)峰,見圖3。表明葡萄糖和甘露糖在給定的水解條件下基本穩(wěn)定,但長(zhǎng)時(shí)間高溫導(dǎo)致少量其他物質(zhì)的生成。2.2.4黨建糖凝劑的抗氧化活性獲得的3種酵母多糖均未能完全水解,在3.95min處出現(xiàn)了未水解的多糖和部分雜質(zhì)峰,7.86min處的峰為葡聚糖水解后的葡萄糖峰,8.87min處的峰為甘露聚糖水解后的甘露糖峰。在TFA濃度為2mol/L,110℃條件下水解6h,DT1在3.95min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為46%的峰,在8.87min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為54%的峰,可知DT1為甘露聚糖;DT2在3.95min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為35%的峰,在7.86min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為58%的葡萄糖峰,在8.87min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為6%的甘露糖峰,可知DT2為含少量甘露聚糖的葡聚糖;DT3在3.95min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為18%的峰,在7.86min處出現(xiàn)1個(gè)峰面積為79%的葡萄糖峰,可知DT3為葡聚糖。見圖4。2.3蛋白質(zhì)的測(cè)定3種多糖的總糖含量均在94%以上。DT1為不含葡聚糖的甘露聚糖,但含2.98%的蛋白質(zhì);DT2為含9.4%甘露聚糖的水溶性葡聚糖,葡聚糖含量占總糖含量的90.6%,含1.89%的蛋白質(zhì);DT3為含1.25%甘露聚糖的非水溶性葡聚糖,葡聚糖含量占總糖含量的98%以上,含3.34%的蛋白質(zhì)。3酵母多糖的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)在多糖的純化過程中,使用Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑獲得了良好的澄清效果。澄清時(shí)必須對(duì)澄清劑溶漲24h后再使用,若使用時(shí)發(fā)現(xiàn)澄清劑分散不理想,可用0.5%的醋酸配成0.25%~0.5%濃度的溶液。澄清劑的加樣順序取決于處理溶液的pH環(huán)境,一般原則為:在堿性環(huán)境中,先加入B組分,再加入A組分;在酸性環(huán)境中,先加入A組分,再加入B組分。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)際情況采用先加入B組分,再加入A組分的方法。目前,我國(guó)尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定酵母中多糖的種類和含量。在大多數(shù)有關(guān)酵母葡聚糖的研究中,多采用TFA和濃硫酸水解后,進(jìn)行氣相衍生和液相檢測(cè)酵母多糖的含量。本實(shí)驗(yàn)采用TFA水解,WatersSugerpark-1色譜柱,蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行液相檢測(cè),最佳水解條件為2mol/L的TFA,110℃水解6h,標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的水解程度可達(dá)95%,酵母多糖的水解效果不如標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的水解效果好,可能是酵母多糖中殘留部分鹽分和蛋白,對(duì)多糖的純度和水解程度均有影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,通過堿法提取的酵母多糖DT1均為甘露聚糖;堿法-酶法提取酵母細(xì)胞壁多糖可獲得含少量甘露聚糖的水溶性葡聚糖DT2,葡聚糖含量占總糖含量的90.6%,獲得可溶性酵母葡聚糖對(duì)于酵母葡聚糖在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究具有積極的意義;同樣,堿法-酶法提取獲得的不溶性葡聚糖DT3,葡聚糖占總糖含量的98%以上,即為目前市場(chǎng)上常見的β-1,3-D-葡聚糖。1.3酵母多糖dt3的制備采用堿法-酶法提取啤酒酵母多糖。稱取200g啤酒酵母細(xì)胞壁,放入5L燒杯中,加入3L蒸餾水,60g氫氧化鈉,攪拌均勻,待氫氧化鈉溶解后,將燒杯置70℃水浴,加速攪拌堿提4h,4000r/min離心10min,收集上清,邊加醋酸邊攪拌,至pH值為7,經(jīng)微濾超濾后冷凍干燥,獲得酵母多糖DT1;堿提后的離心沉淀加入1L蒸餾水,調(diào)節(jié)pH值為7,加入ViscozymeL酶2ml,置50℃水浴,酶解5h,4000r/min離心10min,上清液經(jīng)微濾超濾后冷凍干燥,獲得酵母多糖DT2;酶解后的沉淀加水調(diào)節(jié)固形物含量為10%左右,直接噴霧干燥,獲得酵母多糖