固定化微生物載體材料的制備及其在麥汁發(fā)酵中的應用

固定化微生物載體材料的制備及其在麥汁發(fā)酵中的應用

固定化技術是在20世紀中期發(fā)展起來的一種新生物技術。它的發(fā)展可以分為兩個階段。第一個是固定化酶階段，始于20世紀50年代，第二個是固定化細胞階段，誕生于20世紀70年代中期，但后者的應用范圍和發(fā)展前景遠遠超過了第一個。1983年，在美國著名的雜志encyme和美國國立科學院首次提出了“固定化酶”的概念?！肮潭ɑ锎呋瘎币辉~于1983年首次出現(xiàn)在美國著名雜志enhyme和微型生物技術研究所。所謂固定化生物催化劑是一種使用化學或物理方法將游離生物催化劑固定在有限的空間區(qū)域內(nèi)，以保持活性并重復使用的新型生物技術。因此，它具有小型高效、穩(wěn)定、重復和連續(xù)使用、易連續(xù)反應和自動控制等優(yōu)點，提高了產(chǎn)品的純度和過程效率，克服了環(huán)境敏感、性質(zhì)不穩(wěn)定、易迷失或死亡等缺點。同時，固定化生物技術可以充分利用化工過程中的非均勻相氧化技術優(yōu)勢。海藻酸鈉和殼聚糖均是無毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能.海藻酸鈉-殼聚糖已被應用于藥物控制釋放、固定化生物催化劑、細胞培養(yǎng)及微反應器、人體器官和基因運載工具以及分離介質(zhì)等領域,效果良好,應用前景十分廣闊.作者以殼聚糖-海藻酸鈉復合水凝膠固定化啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),并對海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)、殼聚糖質(zhì)量分數(shù)、固化時間、覆膜時間等因素對復合水凝膠的硬度和固定化啤酒酵母發(fā)酵降糖的影響進行研究,以期為殼聚糖-海藻酸鈉復合水凝膠在啤酒釀造方面的應用奠定基礎.1材料和方法1.1試劑及儀器海藻酸鈉(SA)成都市聯(lián)合化工試劑研究所生產(chǎn);殼聚糖(生化試劑,DD≥90%),上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn);冰醋酸(AR),天津市博迪化工有限公司生產(chǎn);氯化鈣(AR),天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn);氯化鈉(AR),汕頭市光華化學廠生產(chǎn);啤酒酵母,廣州微生物研究所生產(chǎn);麥芽汁,珠江啤酒廠生產(chǎn),瓊脂(生化試劑),汕頭市水產(chǎn)品綜合加工廠生產(chǎn).QTS-25TextureAnalyser,CNSFARNELL生產(chǎn);2WAJ阿貝折光儀,上光實業(yè)有限公司生產(chǎn).1.2測試方法1.2.1殼聚糖的制備將酵母菌懸液與除菌海藻酸鈉溶液混合均勻,緩慢滴入體積分數(shù)4%的氯化鈣溶液中即成白色球形顆粒,并緩慢攪拌使其懸浮在氯化鈣溶液中,此時鈉離子與鈣離子相互置換,海藻酸鈣膠珠逐漸硬化定型(球形顆粒),繼續(xù)在氯化鈣溶液中固化2h,然后在體積分數(shù)為0.5%的殼聚糖溶液中覆膜30min,經(jīng)生理鹽水洗滌3次后,置冰箱備用.1.2.2外觀發(fā)酵度測定發(fā)酵度是指麥汁中浸出物被酵母消耗部分與原麥汁浸出物總量之比.發(fā)酵度分為外觀發(fā)酵度、真正發(fā)酵度和最終發(fā)酵度.外觀發(fā)酵度是發(fā)酵過程中外觀糖度降低的百分數(shù),是以糖度表實測外觀殘留糖度而計算的發(fā)酵度.由于測量時未考慮酒精、CO2的影響,所以比實際糖度要低.其測得發(fā)酵度比實際發(fā)酵度要高.本試驗用2WAJ阿貝折光儀測定發(fā)酵前后麥芽汁的糖度,并按下式計算其外觀發(fā)酵度:外觀發(fā)醉度(％)=原麥汁糖度?發(fā)酵后麥汁糖度原麥汁糖度×100%(％)=原麥汁糖度-發(fā)酵后麥汁糖度原麥汁糖度×100%外觀發(fā)酵度越高,表明發(fā)酵過程中外觀糖度降低越大,啤酒酵母的發(fā)酵能力越強,因而它是發(fā)酵管理的一項重要內(nèi)容,也是酵母降糖及啤酒質(zhì)量控制必要措施之一.1.2.3凝膠硬度測定將QTS-25TextureAnalyser上直徑為10mm的圓柱形探頭置于凝膠表面,以15mm/min的速度下降,當圓柱形探頭下降6mm時測得凝膠硬度,單位為克.2結(jié)果與討論2.1固定化載的硬度研究2.1.1海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對載體硬度的影響分別用質(zhì)量分數(shù)為1.0%、1.5%、2%、2.5%和3%的海藻酸鈉制備5個樣品,研究海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對固定化載體硬度的影響,結(jié)果見圖1.由圖1可以看出,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)的增加,載體的硬度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢.其可能是由于隨著海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)的增加,單位體積內(nèi)海藻酸鈉分子數(shù)增多,其長鏈分子堆砌在一起更容易發(fā)生鏈的纏結(jié),勾結(jié)點可看成是可移動的交聯(lián)點,海藻酸鈉分子內(nèi)、分子間也更易形成氫鍵,而氫鍵的締合則類似于交聯(lián)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)點,交聯(lián)點增多則結(jié)構(gòu)致密,從而導致海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)增大時其硬度也隨之增大.海藻酸鈉的質(zhì)量分數(shù)一般不小于1.0%,否則會因聚陰離子溶液的粘度太低而在下滴過程中嚴重變形,凝膠在氯化鈣溶液中難于形成球形顆粒.2.1.2固化時間的影響分別在固化時間為0.5h、1h、1.5h、2h和3h時制備5個樣品,研究固化時間對載體硬度的影響,結(jié)果(圖2)表明,隨著固化時間的增加,載體的硬度也隨之增大.這是由于固化時間越長,海藻酸鈉與氯化鈣的反應就越完全,形成的海藻酸鈣膠珠就越致密.因此用殼聚糖溶液覆膜后的海藻酸鈣-殼聚糖固定化載體具有更好機械強度.2.1.3殼聚糖質(zhì)量分數(shù)對載體硬度的影響分別用質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%的殼聚糖制備5個樣品,觀察殼聚糖質(zhì)量分數(shù)對載體硬度的影響,結(jié)果見圖3.由圖3可以看出,載體的硬度隨著殼聚糖質(zhì)量分數(shù)的增加而不斷增大.當殼聚糖質(zhì)量分數(shù)由0.3%增加到0.5%時,載體硬度增加的速率較快,而質(zhì)量分數(shù)在0.5%～1.0%時,載體硬度增加的速率較為緩慢.這是由于隨殼聚糖質(zhì)量分數(shù)的增加,載體外膜厚度就越大,而殼聚糖本身具有一定的硬度,從而使得載體硬度隨著殼聚糖質(zhì)量分數(shù)增加而增大;但當質(zhì)量分數(shù)達到一定值時,載體外膜厚度增加速率變慢,因而其硬度增加也隨之趨緩.2.1.4覆膜時間對載體硬度的影響分別用覆膜時間為5min、10min、15min、20min和30min制備5個樣品,研究覆膜時間對載體硬度的影響,結(jié)果如圖4所示.從圖4可以看出,載體硬度隨著覆膜時間的增加而不斷增大.這是由于覆膜時間越長,海藻酸鈣與殼聚糖之間的正負電荷的吸附就越完全,同時殼聚糖覆在載體表面的厚度就越大,從而載體硬度也就越大.2.2固定化器的應用研究2.2.1海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對外觀發(fā)酵度的影響按照固定化載體制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù),觀察海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果如圖5所示.從圖5可知,當海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為1%時,載體降糖能力最強,外觀發(fā)酵度達最大.原因可能是當海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)較低時,形成的載體較海藻酸鈉高時透明,且較疏松,固定微生物的能力也較弱,部分酵母從固定化載體中泄露出來成為游離的啤酒酵母,游離的啤酒酵母因直接和麥汁中的可發(fā)酵性糖接觸,所以麥汁糖度下降最快,其外觀發(fā)酵度也最大.2.2.2固化時間對載體外觀發(fā)酵度的影響按照固定化微囊制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變固化時間,觀察固化時間對外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果如圖6所示.從圖6中可以看出,固化時間為3h時,載體外觀發(fā)酵度最大.這是由于海藻酸鈉與鈣鹽作用后,分子中鈉離子與鈣離子進行交換,生成海藻酸鈣.由于Ca2+的交聯(lián)作用,隨著固化時間的增加分子間相互作用力增強,使線性分子彼此相互連接形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),酵母在其中活動空間增加,繁殖加快,降糖速率也隨之加快.2.2.3殼聚糖含量對降糖效果的影響按照固定化微囊制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變殼聚糖質(zhì)量分數(shù),研究殼聚糖質(zhì)量分數(shù)對外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果(圖7)表明,殼聚糖溶液質(zhì)量分數(shù)雖然相差不大,但覆膜后降糖能力卻有明顯區(qū)別.當殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為0.8%時,外觀發(fā)酵度最大.本試驗采用的殼聚糖脫乙酰度大于90%,即殼聚糖分子鏈上氨基的數(shù)量占90%以上,而乙酰氨基數(shù)量在10%以下.由于殼聚糖分子中存在大量的氨基,氨基易發(fā)生電離而帶正電荷,可與海藻酸鈣分子中大量帶負電荷的羧基通過正負電荷吸引形成聚電解質(zhì)膜.當殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為0.8%時,形成的殼聚糖—海藻酸鈣聚電解質(zhì)膜能使海藻酸鈣—殼聚糖固定化載體具有較合適的強度和較好的滲透擴散性能,因而其外觀發(fā)酵度最大.2.2.4覆膜時間和覆膜厚度對啤酒外觀發(fā)酵度的影響包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變覆膜時間,觀察覆膜時間對外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果(圖8)表明,不同覆膜時間處理間其外觀發(fā)酵度相差并不是很大.當覆膜時間為10min時,其外觀發(fā)酵度最大.這是因為隨覆膜時間的延長,載體外的殼聚糖膜越厚,滲透擴散性能下降,載體中游離的啤酒酵母與可發(fā)酵性糖接觸較少.因而外觀發(fā)酵度不高.所以膜并不是越厚越有利于發(fā)酵,適當?shù)哪ず穸炔庞欣跔I養(yǎng)物質(zhì)的進入以及代謝物質(zhì)的排出.3聚糖質(zhì)量分數(shù)對載體硬度的影響海藻酸鈉與殼聚糖可形成復合水凝膠,它可作為一種載體材料用于固定啤酒酵母,并