中國黃酒麥曲香氣成分的定性與分析

中國黃酒麥曲香氣成分的定性與分析

小麥法和小麥法是中國黃酒的制備工藝的特點。人們普遍認(rèn)為，被稱為“酒之骨”的麥曲是黃酒釀造的動力，具有“糖化、發(fā)酵、生香”功能，對黃酒釀造起著舉足輕重的作用。但是，對于麥曲的理解和研究還停留在簡單的生物學(xué)作用上，僅僅以糖化力、液化力和發(fā)酵力作為評價麥曲質(zhì)量優(yōu)劣的指標(biāo)。隨著黃酒釀造科學(xué)的發(fā)展，黃酒的生產(chǎn)科研人員雖然已經(jīng)認(rèn)識到黃酒麥曲對黃酒風(fēng)味的重要性，但是受到研究理念和技術(shù)的限制，對于非常重要的麥曲“生香功能”涉及極少，只停留在推測和分析上。在過去對黃酒麥曲的研究中，并沒有系統(tǒng)地研究麥曲風(fēng)味特征，更沒有用現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)手段對麥曲風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行科學(xué)的研究。麥曲賦予黃酒的“生香功能”，不僅在于能給黃酒提供生成香味成分的酶及風(fēng)味前驅(qū)物質(zhì)，更重要的是本身也含有豐富的香氣物質(zhì)，是黃酒風(fēng)味的直接給予者。因此，要了解黃酒麥曲對黃酒風(fēng)味的作用，首先得用現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)手段，來了解黃酒麥曲中主要香氣化合物的種類和含量及有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物。日本清酒米曲對清酒的作用和中國黃酒麥曲對黃酒的作用非常相似。高橋美繪等用頂空吸附萃取技術(shù)對日本清酒米曲中的香氣物質(zhì)進(jìn)行了研究。共鑒定出11種香氣化合物，并且發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基-2-庚烯-6-酮、苯乙醛、1-辛烯-3-醇是米曲的重要香氣物質(zhì)。雖然日本清酒米曲中香氣物質(zhì)的研究對我國黃酒麥曲香氣研究有重要的參考意義，但是日本清酒米曲是由純種培養(yǎng)的米曲霉發(fā)酵制成，曲菌較單一，其代謝產(chǎn)物也較為簡單，鑒定出的風(fēng)味物質(zhì)也很少，因而對黃酒的借鑒作用有限。黃酒麥曲微生物菌群復(fù)雜，隨之產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也很豐富，分析其中的香氣物質(zhì)存在一定的困難，有必要尋找更好的方法來研究其中的香氣物質(zhì)。黃酒麥曲中究竟含有何種香氣物質(zhì)、含量多少、有多大貢獻(xiàn)、用何種技術(shù)、方法和手段來分析，目前還是個盲點。黃酒麥曲揮發(fā)性香氣成分含量甚微，要檢測其中的揮發(fā)性香氣化合物，首先得對樣品進(jìn)行濃縮預(yù)處理。常見的濃縮預(yù)處理方有液-液萃取法、蒸餾法、固相萃取法、固相微萃取(SPME)法等。其中SPME法具有操作簡單、快速、靈敏度高、選擇性好、樣品量少、無需溶劑的優(yōu)點。近些年來，SPME法在食品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，如在食醋、蘋果酒、白酒中香氣物質(zhì)分析方面的成功應(yīng)用。隨著食品風(fēng)味分析的發(fā)展，SPME法在中國黃酒風(fēng)味物質(zhì)方面的分析，也得到了令人滿意的結(jié)果，如陸燕等用頂空固相微萃取法(HS-SPME)對用傳統(tǒng)法和糯米膨化法釀造的黃酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行的分析檢測，羅濤等用頂空固相微萃取法對黃酒中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性微量成分進(jìn)行了分析研究，鑒定出的揮發(fā)性和半揮發(fā)性微量成分有97種。故研究選擇頂空固相微萃取法來分析黃酒麥曲中香氣物質(zhì)。對黃酒麥曲中的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析，首先必須準(zhǔn)確鑒定出黃酒中的香氣物質(zhì)的種類。目前國內(nèi)對食品中香氣物質(zhì)的定性一般直接采用氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)分析。而GC-MS只能初步嘗試性地鑒定其中的微量成分，并不能有效地、準(zhǔn)確地鑒定出樣品中香氣活性物質(zhì)。氣相色譜-嗅聞法(GC-O)是解決這一問題的理想方法，該技術(shù)是目前國際上最為先進(jìn)的、可以將氣味檢測儀與氣相色譜儀結(jié)合的一種風(fēng)味化合物分析技術(shù)。不僅如此，采用氣相色譜-嗅聞法中的香氣強(qiáng)度法（GC-Osme）還能幫助初步推斷樣品中有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物。近年來，氣相色譜-嗅聞法在國外的應(yīng)用已得到了蓬勃發(fā)展，如在葡萄酒、干酪等食品風(fēng)味分析方面的應(yīng)用。因而研究采用GC-Osme法，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法來定性分析黃酒麥曲中的香氣物質(zhì)。要準(zhǔn)確得知黃酒麥曲中香氣物質(zhì)的含量需要對其進(jìn)行定量分析。而定量分析得出的香氣物質(zhì)濃度只能給出其在黃酒麥曲中的具體含量，并不能準(zhǔn)確反映其在黃酒麥曲中的香氣貢獻(xiàn)及貢獻(xiàn)程度，香氣活力值（OAV）可以達(dá)到這種目的。香氣活力值是指香氣化合物的濃度和香氣閾值之比，香氣閾值是指嗅覺器官所感覺到的香氣化合物氣味時的最低濃度。只有那些含量超過其香氣閾值的化合物才有香氣貢獻(xiàn)，并且香氣活力值大的香氣化合物其香氣貢獻(xiàn)亦大。因而本研究采用香氣活力值法來準(zhǔn)確分析黃酒麥曲中有重要貢獻(xiàn)的香氣物質(zhì)。本研究采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法、GC-O香氣強(qiáng)度法及香氣活力值（OAV）法對中國黃酒麥曲中的香氣成分進(jìn)行定性定量分析，對黃酒麥曲中主要香氣化合物的種類和含量及有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物進(jìn)行較全面的研究。以拓展到對黃酒麥曲中香氣物質(zhì)的形成機(jī)理、黃酒麥曲曲香與黃酒風(fēng)格相關(guān)組分關(guān)系的研究，以豐富黃酒的釀造科學(xué)與理論，以期應(yīng)用于黃酒業(yè)黃酒風(fēng)味的調(diào)控和黃酒質(zhì)量的提高。1材料和方法1.1標(biāo)樣、無水乙醇黃酒麥曲：均由江、浙、滬、魯黃酒廠提供。氯化鈉和氯化鈣均為分析純：購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；其余標(biāo)樣、無水乙醇均為色譜純。2-辛醇(96%)和2-苯乙醇(99%)：購自Fluka公司(SigmaAldrich,China)；辛酸(98%)；購自吳江慈云香料香精有限公司；己醛(98%)：購自北京北大正元科技有限公司；其他(純度均>98%)均購自Sigma-Aldrich(中國)公司。1.2方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品配制到無水乙醇中，再稀釋制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)標(biāo)混合溶液：2-辛醇和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的無水乙醇溶液。1.2.2化合物的測定采用HS-SPME和GC-MS分析麥曲中的揮發(fā)性香氣化合物，按參考文獻(xiàn)的方法。GC-MS分析：安捷倫公司6890NGC和5975MS。進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250℃，He為載氣，流速為2mL/min。毛細(xì)管色譜柱為FFAP(60m×0.25mm×0.25μm)。程序升溫：50℃恒溫2min，以6℃/min的速度升溫至230℃，保持15min。EI電離源，溫度為230℃，電子能量70eV。物質(zhì)的定性分析：是將未知物的圖譜與NIST05a.LDatabase(AgilentTechnologiesInc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對，結(jié)合物質(zhì)香氣，并與標(biāo)準(zhǔn)物的保留時間、香氣進(jìn)行對比驗證，確定所檢出的化合物。物質(zhì)的定量分析：采用國際上流行的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)加入法，即每個香氣化合物分別對應(yīng)于內(nèi)標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過GC–MS檢測后利用待測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的相對峰面積比代入相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出待測物質(zhì)在麥曲中的含量。香氣活力值(OAV)：香氣活力值是香氣化合物的濃度與該香氣化合物的香氣閾值濃度（在水中的濃度）之比。2結(jié)果和分析2.1揮發(fā)性香氣化合物黃酒麥曲成分復(fù)雜，用HS-SPME和GC-MS能夠檢測到很多種揮發(fā)性微量成分經(jīng)，附圖為HS-SPME檢測的所得GC-MS總離子流譜圖。但是，不是所有的揮發(fā)性物質(zhì)都能呈現(xiàn)香氣，因此結(jié)合GC-O香氣強(qiáng)度法分析，確定了黃酒麥曲中有香氣特征的揮發(fā)性香氣化合物。黃酒麥曲中揮發(fā)性香氣化合物的定性檢測結(jié)果見附表。共鑒定出了42種揮發(fā)性香氣化合物，其包括2種醛類化合物、3種酮類化合物、11種醇類化合物、3種酯類化合物、5種酸類化合物、5種芳香族化合物、1種呋喃類化合物、1種含硫化合物、1種內(nèi)酯類化合物、5種酚類化合物、5種含氮化合物。其中，香氣最強(qiáng)的物質(zhì)有1-辛烯-3-酮（蘑菇香）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（辛辣味，丁香）等。香氣強(qiáng)的物質(zhì)有己醛（青草香，蘋果香）、己酸乙酯（水果香，花香，甜香）、辛酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香，蜂蜜香）、愈創(chuàng)木酚（辛辣氣味，丁香，煙熏氣味）、香蘭素（香草香）等?？梢猿醪酵茢噙@些化合物對黃酒麥曲的生香功能起著重要的作用。黃酒麥曲中有著如此多的香氣成分，也證明了其生香功能對黃酒風(fēng)味貢獻(xiàn)的重要性。2.2分離出合理的香氣化合物對已定性的42種揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行了定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到了在黃酒麥曲中的準(zhǔn)確含量。附表也列出了黃酒麥曲中揮發(fā)性香氣化合物含量情況。在所定量的化合物中，含量居前三位的化合物依次是乙酸乙酯（11831.39μg/kg）、異戊醇（3158.62μg/kg）、苯乙醇（2410.32μg/kg）。預(yù)計這3種化合物對構(gòu)成黃酒麥曲整體香氣的基本骨架有比較重要的影響。從附表可以看出，酯類、醇類、酸類、酚類及其衍生物含量較豐富，推測對黃酒麥曲的整體風(fēng)味有較大影響。但化合物含量高并不意味著對黃酒麥曲的貢獻(xiàn)就大，需要結(jié)合對應(yīng)的閾值才能間接判定其在黃酒麥曲中的重要性。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，得到42種揮發(fā)性香氣化合物在水中的香氣閾值，根據(jù)濃度和香氣閾值之比，計算出了香氣化合物在黃酒麥曲中的OAV值。結(jié)果表明（見附表）：麥曲的揮發(fā)性香氣化合物中有18種化合物的濃度高于其香氣閾值，說明這18種化合物對黃酒麥曲都有一定的香氣貢獻(xiàn)。其中OAV值在1～5的香氣化合物有2-庚酮、2-辛酮、3-辛醇、乙酸乙酯、苯乙醇、4-甲基苯酚。這些化合物對黃酒麥曲的曲香都有不同程度的貢獻(xiàn)。OAV值在5～10的香氣化合物有異戊醇、庚醇、苯并噻唑、γ-壬內(nèi)酯。這些化合物對黃酒麥曲的曲香都有較大的貢獻(xiàn)。OAV值大于10的香氣化合物有1-辛烯-3-酮（OAV=618.11）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（OAV=386.01）、1-辛烯-3-醇（OAV=291.45）、己酸乙酯（OAV=142.13）、己醛（OAV=109.18）、辛酸乙酯（OAV=51.36）、愈創(chuàng)木酚（OAV=21.29）、苯乙醛（OAV=13.36）。故可以推斷，這些化合物對黃酒麥曲有重要貢獻(xiàn)，是黃酒麥曲中最重要的特征香氣化合物。通常，香氣強(qiáng)度大的物質(zhì)同時亦具有較大的OAV值。如1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等香氣強(qiáng)度大的物質(zhì)，其OAV值也大。但實際結(jié)果表明，也有例外，一些香氣強(qiáng)度大的物質(zhì)，卻含量甚微，甚至未被定量測出，如香蘭素。分析原因是由于香蘭素的香氣閾值極低，因此香氣強(qiáng)，但其濃度卻極低，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線下限，因而未被定量出。根據(jù)香氣強(qiáng)度和OAV值結(jié)果可以斷定：1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等這些化合物是黃酒麥曲中重要的香氣化合物，對黃酒麥曲香氣貢獻(xiàn)非常大。1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇在黃酒麥曲中香氣強(qiáng)度大、OAV值高，是黃酒麥曲中最重要的香氣物質(zhì)，它們在日本米曲中也很重要。其中1-辛烯-3-醇來源于微生物產(chǎn)生的磷脂β-氧化反應(yīng)，其前驅(qū)物質(zhì)是亞油酸，而1-辛烯-3-酮則是由1-辛烯-3-醇通過酶的氧化作用而形成的。日本清酒米曲的香氣物質(zhì)研究中，發(fā)現(xiàn)在米曲的制作過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物菌體不斷繁殖生長，亞油酸的濃度也不斷增加，1-辛烯-3-醇含量也增加，他們推斷在制曲過程中，亞油酸可作為菌體生長的一個指標(biāo)。為此我們也可以在黃酒麥曲的制曲過程中，根據(jù)香氣物質(zhì)1-辛烯-3-醇的含量來判斷黃酒麥曲的發(fā)酵情況，因此香氣物質(zhì)的含量可以作為判斷麥曲發(fā)酵好壞的重要信息源。另外，己醛也是黃酒麥曲中重要的香氣物質(zhì)，賦予麥曲以優(yōu)雅的青草香氣，己醛也來源于磷脂β-氧化反應(yīng)，前驅(qū)物質(zhì)是亞油酸。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚是黃酒麥曲中另一類重要香氣物質(zhì)，賦予麥曲辛辣味、煙熏氣味、丁香、中藥氣味。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在黃酒麥曲中香氣強(qiáng)度大，OAV值也高，主要來源于微生物發(fā)酵中阿魏酸的脫羧反應(yīng)，此反應(yīng)的微生物主要有霉菌（如白腐菌，黑曲霉和青霉菌等）、酵母（如釀酒酵母、漢遜氏酵母、假氏酵母等）、某些細(xì)菌（如枯草芽胞桿菌、短小芽胞桿菌、植物乳桿菌、和熒光假單胞桿菌等）和放線菌如鏈霉菌等。阿魏酸在糧谷類含量豐富，在小麥中含量為0.05g/kg～0.5g/kg。以阿魏酸為前驅(qū)物質(zhì)，由微生物代謝，可以產(chǎn)生一系列的揮發(fā)性酚類化合物，除產(chǎn)生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚外，還產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、香蘭素、4-乙基愈創(chuàng)木酚等。香蘭素呈現(xiàn)令人愉快的香草香，其含量甚微，但閾值低，故在GC-O聞香中檢測其香氣強(qiáng)。己酸乙酯和辛酸乙酯表現(xiàn)為水果香、甜香和花香，它們也是黃酒麥曲中重要的香氣化合物，給麥曲以令人愉快的香氣。酯類物質(zhì)來源于醇和酸的酯化反應(yīng)，也可以來源于微生物的醇?；D(zhuǎn)移酶和醇的縮合反應(yīng)。因此它們的形成和微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酰輔酶A有關(guān)。苯乙醛是清酒米曲中重要的香氣化合物，在中國黃酒麥曲中也非常重要。苯乙醛賦予黃酒麥曲令人愉悅的、柔和的玫瑰花香、蜂蜜香，主要來源于微生物氨基酸代謝，其前驅(qū)物質(zhì)是苯丙氨酸。3酒精麥曲中主成分的檢測研究運用頂空固相微萃取法(HS–SPME)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、GC-O香氣強(qiáng)度法及香氣活力值（OAV）法的新技術(shù)和手段，全面剖析了黃酒麥曲中的香氣物質(zhì)，為黃酒麥曲的風(fēng)味分析提供了思路和技術(shù)。研究采