啤酒酵母絮凝機(jī)理的假說

啤酒酵母絮凝機(jī)理的假說

啤酒母親的凝縮性在啤酒生產(chǎn)中起著特殊的作用。凝縮性差異影響著發(fā)酵速度和發(fā)酵程度，阻礙了啤酒過濾方法的選擇，阻礙了多重發(fā)酵，并影響了啤酒的味道。自19世紀(jì)70年代法國人LouisPasteur首先在酵母體系中發(fā)現(xiàn)了絮凝現(xiàn)象,迄今已經(jīng)130多年,在此期間諸多專家學(xué)者致力于酵母絮凝機(jī)理的研究,尤其是20世紀(jì)50年代以來,通過從遺傳學(xué)及分子生物學(xué)方面去揭示絮凝機(jī)理,取得了很大的突破。本文擬就啤酒酵母絮凝機(jī)理研究方面進(jìn)行簡要綜述。1葡萄酒和發(fā)酵母的凝縮機(jī)制的假設(shè)1.1酵母細(xì)胞絮凝機(jī)理早期的有關(guān)研究者根據(jù)各自對(duì)酵母絮凝現(xiàn)象的觀察與研究,相繼提出了一些試圖解釋絮凝機(jī)理的假說,有“絮凝共生假說”、“蛋白質(zhì)沉淀假說”、“絮凝膠體假說”、“鈣橋假說”等,他們?cè)噲D從酵母污染、培養(yǎng)基內(nèi)蛋白依附酵母細(xì)胞壁、膠體理論、鈣離子作用等方面來解釋酵母細(xì)胞的絮凝機(jī)理。如Mill提出酵母絮凝的產(chǎn)生是由于細(xì)胞壁表面多糖的氫與羥基之間的氫鍵作用和陰離子基團(tuán)間以Ca2+為鹽橋的聯(lián)結(jié)作用。這些假說考慮的層面過于簡單且各有缺陷,隨著對(duì)絮凝機(jī)理研究的不斷深入,目前已經(jīng)很少有人支持。1.2鈣離子橋連接其他細(xì)胞的-甘露聚糖位點(diǎn)Miki指出,絮凝的產(chǎn)生是源于絮凝性酵母細(xì)胞表面的識(shí)別因子通過鈣離子橋連接其他細(xì)胞的α-甘露聚糖位點(diǎn),該識(shí)別因子是類似外源凝集素活性的蛋白質(zhì),由專一的顯性基因FLO1編碼控制。因?yàn)?α-甘露聚糖、FL01編碼蛋白和Ca2+是酵母絮凝所必需的,見圖1。1.3圖像絮凝活性Teunissen提出:酵母細(xì)胞壁上的特定表面蛋白(絮凝素)直接與相鄰酵母細(xì)胞壁上的甘露糖殘基之間的專一性結(jié)合引起絮凝,鈣離子起到助凝劑的作用,促使絮凝素與甘露糖殘基的特異結(jié)合。由于絮凝性酵母和非絮凝性酵母的細(xì)胞壁表面都存在甘露糖殘基,因此能否發(fā)生絮凝的主要因素就在于是否有絮凝素存在。Straver等人首次從啤酒酵母細(xì)胞壁分離到酵母細(xì)胞絮凝活性的絮凝素,將分離到的絮凝素加入到絮凝酵母細(xì)胞后明顯增強(qiáng)細(xì)胞的絮凝能力,加入到非絮凝酵母細(xì)胞后能使細(xì)胞呈弱絮凝能力。在Nishihara等人進(jìn)行的非絮凝酵母和絮凝性酵母的共絮凝研究也證實(shí)并支持了絮凝素假說。絮凝素假說模型如圖2所示。2lo1型表型在加入甘露糖的培養(yǎng)基中,絮凝作用被抑制,是由于自由的甘露糖占據(jù)了特定表面蛋白的結(jié)合位點(diǎn),使之無法完成與細(xì)胞表面甘露糖殘基的結(jié)合,這種現(xiàn)象稱為酵母絮凝的糖抑制。根據(jù)啤酒酵母細(xì)胞的糖抑制圖譜,可以分為兩種表型:FLO1型和NewFLO型。FLO1型只被甘露糖抑制,而不被葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和半乳糖抑制;NewFLO型可以被甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖抑制,而不被半乳糖抑制。這兩種有明顯區(qū)別的表型分別由FLO1基因和Lg-FLO1基因控制,兩種基因在196號(hào)、240號(hào)氨基酸上的差異決定了兩種表型的差別。目前,我國啤酒生產(chǎn)中使用的下面發(fā)酵啤酒酵母大多屬于NewFLO型,而上面發(fā)酵啤酒酵母多屬于FLO1型。有研究者通過對(duì)比兩種表型的酵母的生理生化特性,提出兩種絮凝型酵母的絮凝機(jī)理可能分別屬上述兩種絮凝假說之一。但除了以上兩種常見表型之外,近來又有研究者發(fā)現(xiàn)存在對(duì)甘露糖不敏感的個(gè)別酵母菌株,它們的絮凝作用機(jī)理無法用類外源凝集素和絮凝素假說來解釋。Straver等人的研究指出,在某些情況下,絮凝不僅僅依賴于絮凝素,而且需要凝集素和類纖維結(jié)構(gòu)的存在。3酵母絮凝的發(fā)現(xiàn)1951年,在Brighton舉行的歐洲釀造會(huì)議上提出酵母絮凝是一種可遺傳的特性,開啟了從遺傳角度出發(fā)去研究絮凝機(jī)理的新潮,到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近40個(gè)與酵母絮凝有關(guān)的基因,見表1。3.1flo1基因序列及特點(diǎn)編碼絮凝蛋白的基因稱為FLO基因,發(fā)現(xiàn)最早、研究最為廣泛的絮凝基因是FLO1,其他重要的FLO基因還有FLO2,FLO4,FLO5,FLO3,FLO6,FLO7,FLO9,FLO11,Lg-FLO1等,把它們統(tǒng)稱為FLO基因家族。Rusell研究證明FLO1,FLO2和FLO4是等位基因。Wateri等人對(duì)FLO1基因進(jìn)行了克隆和序列分析,研究表明,完整的FLO1基因位于Ⅰ號(hào)染色體的右臂上,編碼1537個(gè)氨基酸的4611bp組成了FLO1基因的開放閱讀框架,FLO1蛋白的顯著特征是含有4種重復(fù)序列和大量的絲氨酸和蘇氨酸,FLO1蛋白C-末端和N-末端區(qū)域均呈疏水性。Bidard等進(jìn)行了FLO5基因的克隆和分析,證明FLO5基因是顯性基因,可以通過熱處理或蛋白酶處理等生理生化實(shí)驗(yàn)分析區(qū)別FLO5和FLO1基因控制的絮凝表型。顯性基因FLO9與arg4呈松散連接,受交配型的影響,FLO11表達(dá)也受到交配型的控制。Lg-FLO1基因編碼的絮凝蛋白可以同甘露糖和葡萄糖結(jié)合,表現(xiàn)為NewFLO絮凝表型。通過不同絮凝基因的克隆、序列分析和表達(dá),為研究絮凝機(jī)理提供了有力的手段和方法。3.2flo基因家族在菌株間的作用Stratford指出,當(dāng)FLO基因啟動(dòng)后,絮凝蛋白產(chǎn)生,絮凝現(xiàn)象也就隨之而產(chǎn)生。但他的論點(diǎn)很快被否定。相反,某些能激發(fā)FLO基因的因素有可能會(huì)阻礙絮凝的發(fā)生,僅從FLO基因家族來看,絮凝現(xiàn)象的背后有著錯(cuò)綜復(fù)雜的原因:首先,FLO基因家族是相當(dāng)不穩(wěn)定的,在不同的菌株種系甚至是同一菌株的不同的代數(shù)中,FLO基因可能存在很大的差異;其次,FLO基因家族包含多種不同的FLO基因,它們中的每一個(gè)基因可能分別由不同的復(fù)4機(jī)制所調(diào)控,可以由不同的因素誘導(dǎo)或阻遏。Kobayashi對(duì)FLO8進(jìn)行了克隆測(cè)序,結(jié)果表明FLO8并非絮凝結(jié)構(gòu)基因,而是起到FLO1和FLO9基因轉(zhuǎn)錄激活子的作用。除FLO基因引起的絮凝之外,還發(fā)現(xiàn)一些突變也會(huì)引起絮凝,其表型與FLO1型相似,如CYC8和TUP1突變型。對(duì)TUP1和CYC8的克隆和測(cè)序結(jié)果表明,除TUP1與編碼G蛋白β-亞基同源外,未發(fā)現(xiàn)與其他蛋白同源,這意味著TUP1和CYC8具調(diào)節(jié)特性,其產(chǎn)物可能是多效調(diào)節(jié)因子,與絮凝激活子和結(jié)構(gòu)基因相互作用。此外,細(xì)胞壁基因abs,wal突變也會(huì)引起絮凝,線粒體基因組中的olie和oxi2的缺失導(dǎo)致菌株絮凝能力的喪失。在表1中列出了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的FLO基因的調(diào)節(jié)基因及線粒體基因和異源基因。4葡萄糖母凝膠物的改進(jìn)和應(yīng)用4.1啤酒絮凝性差在啤酒釀造過程中,不僅要求酵母快速發(fā)酵麥汁,而且要求酵母在發(fā)酵結(jié)束時(shí)形成稠密的沉淀。絮凝性差的酵母能實(shí)現(xiàn)快速發(fā)酵,但發(fā)酵液澄清緩慢,造成過濾困難;相反,那些絮凝能力太強(qiáng)的菌株則通常會(huì)從發(fā)酵液中過早的絮凝而分離出來,導(dǎo)致后發(fā)酵不完全,造成啤酒口味不佳且生物穩(wěn)定性較差。所以,一直以來對(duì)啤酒酵母絮凝性狀的選擇成為釀造師必須要考慮的因素。4.1.1外添加酵母絮凝劑雖然可以通過基因改良的方式提高酵母的絮凝能力,但酵母絮凝性提高會(huì)影響啤酒的發(fā)酵度,不利于生產(chǎn)淡爽型啤酒。在酵母絮凝性改良受到發(fā)酵度制約的情況下,可以采用外添加酵母絮凝劑,誘導(dǎo)酵母非自發(fā)絮凝,在發(fā)酵終了時(shí)使酵母迅速凝聚沉淀下來。筆者認(rèn)為可以考慮的途徑有3點(diǎn):①使用傳統(tǒng)的啤酒絮凝澄清劑,如魚膠等;②利用啤酒酵母與其他微生物的吸附作用,篩選出可絮凝啤酒酵母的新型微生物絮凝劑;③利用基因工程手段,獲得大量絮凝蛋白,向發(fā)酵液加入絮凝蛋白以調(diào)控酵母絮凝程度。4.1.2酵母絮凝活性研究目前,已完成對(duì)FLO1基因的克隆和序列分析并用以轉(zhuǎn)化上面和下面發(fā)酵酵母,所得轉(zhuǎn)化子的絮凝性都比它們的母株強(qiáng)。Watari等人FLO5菌株與工業(yè)菌株雜交或原生質(zhì)體融合,得到絮凝性較強(qiáng)的酵母。郭文潔等進(jìn)行了絮凝基因在啤酒酵母菌株中的表達(dá)研究。但目前FLO基因修飾酵母應(yīng)用于啤酒工業(yè)中所面臨的最大問題依然突出,即酵母在發(fā)酵后期細(xì)胞數(shù)太少,導(dǎo)致發(fā)酵速率急劇下降,后發(fā)酵不完全。如果能找到一種方法控制FLO基因只在發(fā)酵達(dá)到一定程度后方可高效表達(dá),那么將對(duì)啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。4.2母因子方案在其他方面的應(yīng)用4.2.1生物營養(yǎng)的應(yīng)用酵母表達(dá)載體一般以藥物抗性或營養(yǎng)缺陷型作為選擇標(biāo)記,但抗藥性基因的引入可能會(huì)出現(xiàn)食品安全等問題,而大多數(shù)工業(yè)菌株是營養(yǎng)型,為獲得營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行誘變?nèi)菀资乖行誀畎l(fā)生改變。利用絮凝性使細(xì)胞分離的特性,可用作選擇性標(biāo)記,構(gòu)建絮凝選擇載體,減少食品安全隱患。劉小琳等以絮凝基因FL01為選擇性標(biāo)記構(gòu)建酵母表達(dá)載體,利用該載體克隆并表達(dá)了β-葡萄糖苷酶基因。4.2.2酵母細(xì)胞表層展示和定向進(jìn)化絮凝素蛋白具有糖基磷酸肌醇(GPI)錨定點(diǎn),利用絮凝素Flolp的C末端的膜錨定功能區(qū)和N末端絮凝功能區(qū)可構(gòu)建成兩個(gè)酵母細(xì)胞表層展示體系,有望實(shí)現(xiàn)多種酶和功能蛋白的展示和定向進(jìn)化。Matsumoto利用絮凝蛋白與脂肪酶N末端的連接成功將高活性脂肪酶展示在酵母細(xì)胞表面。4.2.3酵母絮凝性狀的控制利用酵母絮凝蛋白與細(xì)菌