牛雙胎性狀的多態(tài)檢測(cè)

牛雙胎性狀的多態(tài)檢測(cè)

牛的繁殖性能直接關(guān)系到是否對(duì)人口生產(chǎn)的生產(chǎn)效率和市場(chǎng)需求的快速響應(yīng)?，F(xiàn)在，中國(guó)的牲畜養(yǎng)殖已經(jīng)開始關(guān)注集中管理和規(guī)?；?，并逐漸進(jìn)入國(guó)際一體化。在中國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)中，黃牛從傳統(tǒng)的服務(wù)方式轉(zhuǎn)變?yōu)槿庥?，?yōu)質(zhì)的生豬新品種（系）被列入未來15年的全國(guó)牲畜發(fā)展計(jì)劃。然而，牛屬于一只單獨(dú)的動(dòng)物。通常，一個(gè)胎產(chǎn)一個(gè)小牛，繁殖率低。自然條件下，雙胎率僅為0.15%2.99%，這極大地限制了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。因此，提高牛的繁殖率是半個(gè)世紀(jì)以來研究牛育種的一個(gè)熱點(diǎn)。經(jīng)過10多年的研究（1982-1993），雙胎率從3.4%提高到28.5%。這表明，即使是對(duì)這種雙胎的遺傳因素也可以通過遺傳改良來改善，但目前的遺傳機(jī)制尚不清楚。根據(jù)這項(xiàng)研究，雙胎率可以提高為28.5%。這意味著雙胎有遺傳基礎(chǔ)，可以通過遺傳改良。然而，目前尚不清楚遺傳機(jī)制。根據(jù)這項(xiàng)研究，雙胎和卵（esr）之間的遺傳關(guān)系接近于1.00。因此，牛的研究表明，例如，rothschild等人以祖母遺傳基因（esr）作為豬的育種方法，研究發(fā)現(xiàn)esr的存在于esr基因的等位基因b（3.7kg帶）下。因此，if和zhao采用fsh基因作為改良后代（0.2kg）。研究結(jié)果表明，bb-純合子（0.2kg）祖母比純母豬高2.53頭，平均產(chǎn)仔數(shù)為2.12頭，最大產(chǎn)仔數(shù)為1.5%。促卵泡素(FSH)是由垂體分泌的一種促性腺激素,它與卵巢上的FSH受體結(jié)合而激活cAMP路徑,從而起到促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟以及最終引發(fā)排卵.而對(duì)FSHR基因結(jié)構(gòu)的研究表明,FSHR屬于一個(gè)數(shù)目龐大的G蛋白耦合受體超家族的成員之一;這個(gè)超家族包括有大約100多個(gè)受體,腎上腺素能受體是其典型代表;該類受體蛋白肽鏈在功能和結(jié)構(gòu)上分為跨膜域、胞外域和胞內(nèi)域3部分,最顯著的特點(diǎn)是跨膜域在細(xì)胞膜上來回折疊形成7段跨膜段;FSHR的10個(gè)外顯子中,第10外顯子編碼胞內(nèi)域和跨膜域,胞外域則由第1～9外顯子編碼.由此可見,第10個(gè)外顯子的功能是非常重要的.Rahal等報(bào)道,發(fā)現(xiàn)了牛FSHR基因的第10外顯子存在多態(tài)性,但尚未進(jìn)一步確定與繁殖性狀的關(guān)系,所以本研究以秦川牛和荷斯坦奶牛的雙胎母牛為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)FSHR基因的第10個(gè)外顯子的第1387bp至1617bp共230個(gè)堿基的區(qū)段進(jìn)行了SNP(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)分析,并與單胎牛對(duì)照,皆在探討該基因作為候選基因標(biāo)記牛雙胎性狀的可行性,以便于在雙胎牛的選育中參考應(yīng)用.1材料和方法1.1荷斯坦牛奶的采血秦川牛20頭,其中雙胎母牛和單胎母牛各10頭;荷斯坦奶牛32頭,其中雙胎母牛和單胎母牛各16頭.靜脈采血,肝素鈉抗凝,酚、氯仿抽提后,TE溶解,-20℃保存.1.2引物的合成依照參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為230bp,為FSHR基因第10外顯子的一部分.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,序列如下:上游引物:5′-ATCACGCTGGAAAGATGGCATACC-3′下游引物:5′-GACATTGAGCACAAGGAGGGAC-3′1.3聚丙烯酰胺凝膠的制備取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μl于一滅菌離心管中,加入等體積的變性上樣緩沖液(95%去離子甲酰胺10ml、0.5mol/LEDTA(pH8.0)200μl、0.25%二甲苯青FF、0.25%溴酚藍(lán)).95℃水浴中變性5～10min后,立即冰浴5min以上,直至上樣時(shí)取出.電泳采用8%的Acr/bis溶液為29∶1的聚丙烯酰胺凝膠,凝膠中加入5%的甘油.電泳結(jié)束后凝膠銀染.1.4不同因素的pcr產(chǎn)物序列測(cè)量對(duì)出現(xiàn)不同基因型的PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠中電泳并回收,然后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,對(duì)兩個(gè)牛種均進(jìn)行測(cè)序分析.2結(jié)果2.1sscp分析用設(shè)計(jì)的引物對(duì)2個(gè)牛品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2%瓊脂糖電泳檢測(cè),擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性好(Fig.1),可直接進(jìn)行SSCP分析.2.2正常型和突變型對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行SSCP檢測(cè),結(jié)果出現(xiàn)兩種基因型,正常型(純合子,Fig.2中3、5、6、7泳道)和突變型(雜合子,Fig.2中1、2、4、8泳道)這種現(xiàn)象在秦川牛和荷斯坦奶牛均存在.2.3fshr基因突變對(duì)秦川牛和荷斯坦奶牛中出現(xiàn)的純合子和雜合子兩種基因型的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),具有多態(tài)性DNA序列在FSHR基因的第1506個(gè)堿基發(fā)生了突變,即T→C.Fig.3列出了DNA序列和氨基酸序列.2.4單胎牛和雙胎牛中突變體的顯著性檢驗(yàn)牛不同群體突變頻率列于Table1.從表Table1可以看出,無論秦川牛還是奶牛,FSHR基因第10個(gè)外顯子的突變率在雙胎母牛中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單胎母牛.如秦川牛中,10個(gè)雙胎母牛有6個(gè)為突變體,即突變率為60%,而10個(gè)單胎母牛中只有2個(gè)突變體,其突變率為20%,雙胎牛的突變率是單胎牛的3倍,經(jīng)顯著性檢驗(yàn)達(dá)α>0.6的顯著水平(P<0.6).奶牛中16個(gè)雙胎母牛中有5個(gè)突變體,突變率為31.25%;15個(gè)單胎母牛中只有一個(gè)突變體,其突變率為6.67%,雙胎牛的突變率是單胎牛的4.7倍,經(jīng)顯著性檢驗(yàn)達(dá)α>0.1的顯著水平(P<0.1).需要說明的是秦川牛后代及奶牛后代的突變個(gè)體的母親也為突變體.3突變型酵母的fshr基因的外顯子的突變牛的雙胎性狀屬于閾性狀,受很多因素的影響,只有適宜的環(huán)境條件下才能表現(xiàn)為雙胎的表型.通過對(duì)雙胎牛和單胎牛的FSHR基因的第10個(gè)外顯子的研究發(fā)現(xiàn),在秦川牛的雙胎母牛中60%(6/10)是突變型,而在單胎母牛中20%(2/10)是突變型;在荷斯坦奶牛中,雙胎母牛中有31.25%(5/16型的)是突變型,單胎母牛只有6.67%(1/15)為突變型;由此可見雙胎牛和單胎牛二者之間FSHR基因的第10個(gè)外顯子的突變率差異很大.這表明FSHR基因的第10個(gè)外顯子特征有可能作為雙胎性狀的標(biāo)記基因,而且標(biāo)記的結(jié)果也比較明確,即雙胎性狀與候選基因的多態(tài)(突變)性狀呈正相關(guān)關(guān)系.為了進(jìn)一步把突變的單核苷酸定位,對(duì)其進(jìn)行了序列測(cè)定,測(cè)定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在FSHR基因的第1506個(gè)堿基發(fā)生了突變,即T→C,但氨基酸沒有發(fā)生變化.突變型母牛的FSHR基因的第10個(gè)外顯子的突變與Rahal報(bào)道的不太一致,報(bào)道發(fā)生突變的位點(diǎn)除第1506個(gè)堿基由C→T外,還有第1593個(gè)堿基由T→C.但本研究中只有第1506個(gè)堿基的突變,而后者沒有發(fā)生突變,與Rahal研究的根本區(qū)別是他的研究沒有與雙胎性狀間進(jìn)行相關(guān)研究.