一測(cè)多評(píng)分析方法在中藥多成分定量中的應(yīng)用

一測(cè)多評(píng)分析方法在中藥多成分定量中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)是中華民族的瑰寶。如果中醫(yī)藥的質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)，就會(huì)影響中醫(yī)臨床辨證治療的效果。提高中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),是保證廣大患者用藥安全有效的前提。中藥成分的多樣性、復(fù)雜性和作用機(jī)制的模糊性,使其質(zhì)量控制仍然存在許多問題,一定程度上阻礙了中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的進(jìn)程,是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一。中藥的整體作用及多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),決定了任何一個(gè)單一成分作為指標(biāo)都不能準(zhǔn)確反映中藥材、中藥飲片和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。建立中藥的質(zhì)量保證體系應(yīng)立足于中藥的特色,建立多成分、多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式,對(duì)中藥及其制劑的整體藥效進(jìn)行控制,以《中國(guó)藥典》2010年版為代表的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)確立了“從單指標(biāo)向多指標(biāo)、從指標(biāo)性成分向藥效成分控制”的發(fā)展方向。針對(duì)目前中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制中存在的對(duì)照品缺乏的問題,提出了根據(jù)中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測(cè)定一個(gè)成分(對(duì)照品易得、價(jià)廉、有效者)實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分(對(duì)照品難以得到或難供應(yīng)者)同步測(cè)定的一測(cè)多評(píng)(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)的分析方法。該方法提出后得到了業(yè)內(nèi)學(xué)者們廣泛的認(rèn)可,許多研究者進(jìn)行了深入的研究,并在部分中藥材、中藥飲片及中藥復(fù)方制劑中得到了應(yīng)用。本文就一測(cè)多評(píng)法的原理及其研究進(jìn)展進(jìn)行概述,并就其存在的問題和發(fā)展前景進(jìn)行討論。1一般介紹1.1“一測(cè)多評(píng)”法在一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測(cè)器響應(yīng)成正比。在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí),以藥材中某一典型成分(對(duì)照品易得、價(jià)廉、有效者)為內(nèi)參物,根據(jù)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子(relativecorrectionfactor),無需提供鑒別和定位用的對(duì)照品,通過校正因子計(jì)算其他組分的量。這種測(cè)定一個(gè)成分,實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分定量的方法命名為“一測(cè)多評(píng)”法。假設(shè)某樣品中含有i個(gè)組分,fi=Wi/Ai(i=1,2,…,k,…,m),式中Ai為組分峰面積,Wi為組分濃度。選取其中一組分k為內(nèi)參物,建立組分k與其他組分m之間的相對(duì)校正因子fkm=fk/fm=Wk/Wm×(Am/Ak);由此可導(dǎo)出定量計(jì)算公式:Wm=Wk×Am/(fkm×Ak);式中Ak為內(nèi)參物峰面積,Wk為內(nèi)參物濃度,Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m濃度。一測(cè)多評(píng)法原理與校正因子法原理基本一致,在方法學(xué)建立時(shí),選定內(nèi)參物,求出內(nèi)參物與各待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子,并把其作為一個(gè)常數(shù)用于定量測(cè)定中。在定量時(shí),內(nèi)參物的濃度按常規(guī)方法(外標(biāo)一點(diǎn)法、二點(diǎn)法)進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)保留時(shí)間差和/或相對(duì)保留時(shí)間值(分別考察相對(duì)保留值或保留時(shí)間差2種參數(shù)在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性,選取RSD值較小的一種參數(shù)作為峰定位依據(jù)),結(jié)合化合物的紫外吸收特征、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)給出的質(zhì)譜信息等確定目標(biāo)峰的峰位,相對(duì)校正因子結(jié)合內(nèi)參物實(shí)測(cè)濃度,計(jì)算待測(cè)成分的濃度。對(duì)于成分復(fù)雜的樣品,通過相對(duì)保留值或保留時(shí)間差等參數(shù)不能準(zhǔn)確定位時(shí),可選用定性用的對(duì)照品或含有各待測(cè)組分的“中藥對(duì)照提取物”對(duì)待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位。1.21個(gè)研究和評(píng)價(jià)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)1.2.1中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制的問題中藥及其制劑化學(xué)成分與有效成分的多樣性、復(fù)雜性以及相互間的協(xié)同作用,決定了單一成分和指標(biāo)難以準(zhǔn)確、全面地表達(dá)中藥的內(nèi)在質(zhì)量,傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對(duì)中藥進(jìn)行多藥效成分的綜合評(píng)價(jià),而多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式又要求有足夠高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的化學(xué)對(duì)照品作為保障,由于某些化學(xué)對(duì)照品分離難度大或單體不穩(wěn)定難以供應(yīng)、供應(yīng)價(jià)格高等造成了中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制對(duì)照品匱乏的問題,限制了用常規(guī)的外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法來實(shí)現(xiàn)對(duì)多成分的定量和多指標(biāo)的質(zhì)量控制。一測(cè)多評(píng)法利用有效成分間內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測(cè)定一個(gè)成分,實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分的同步測(cè)控,很好地解決了對(duì)照品缺乏的問題,實(shí)現(xiàn)了中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià),符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論的整體觀。1.2.2測(cè)多評(píng)法檢測(cè)中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)模式需要有多種對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,但現(xiàn)有部分中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大、單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)或供應(yīng)價(jià)格高等,使其在品種和數(shù)量上不能滿足中藥質(zhì)量監(jiān)控和新藥研發(fā)等方面的需求,而只能采用逐個(gè)檢測(cè)單一有效成分來控制中藥及其制劑的質(zhì)量的方法,給藥品檢測(cè)帶來諸多不便,降低了檢測(cè)效率。一測(cè)多評(píng)法通過測(cè)定一個(gè)對(duì)照品易得成分(內(nèi)參物)的量,計(jì)算出其他藥效成分對(duì)應(yīng)于這一內(nèi)參物的相對(duì)校正因子,實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)控,尤其是對(duì)照品匱乏成分的測(cè)定。該方法可實(shí)現(xiàn)在對(duì)照品短缺的情況下,進(jìn)行多指標(biāo)成分的測(cè)定,經(jīng)實(shí)踐驗(yàn)證,具有技術(shù)適應(yīng)性和可行性。1.2.3健全的質(zhì)量控制體系難以實(shí)現(xiàn)“難以操作”的“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的藥品如用藥物”等在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)過程中,多采用指紋圖譜技術(shù)來體現(xiàn)中藥的整體性,目前色譜指紋圖譜分析方法已被國(guó)際公認(rèn)為可用于植物藥等復(fù)雜化學(xué)組成體系質(zhì)量控制的有效手段,許多外國(guó)植物藥生產(chǎn)廠家已將其用于藥品質(zhì)量控制中,但其模糊性的特點(diǎn)使其難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用,并造成了“難以說清楚”的局面。而一測(cè)多評(píng)的研究思路側(cè)重從量上闡明主要成分或藥效成分間的相互關(guān)系,是對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步定量挖掘分析,在指紋圖譜整體控制基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確個(gè)別成分的量,為中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的研究思路。1.2.4采用相對(duì)校正因子法測(cè)定中藥質(zhì)量一測(cè)多評(píng)法借鑒經(jīng)典的內(nèi)標(biāo)法、校正因子法、主成分自身對(duì)照法和紫外百分吸收系數(shù)法的優(yōu)勢(shì),在缺少對(duì)照品的情況下,利用成分間的相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)多成分的測(cè)定,對(duì)中藥的質(zhì)量進(jìn)行控制,該方法方便、快速、廉價(jià),大幅度降低了檢測(cè)成本和時(shí)間,提高了工作效率和方法的實(shí)用性,能夠更有效、更全面、更準(zhǔn)確地控制中藥質(zhì)量,將是中藥多組分同步定量的發(fā)展方向。21-測(cè)量和評(píng)估方法的應(yīng)用2.1測(cè)定熱價(jià)要正因子一測(cè)多評(píng)法提出之后,已經(jīng)在丹參、黃連、金銀花、赤芍、人參和三七等20多種藥材的多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制中得到了探索和應(yīng)用(表1)。楊菲等以丹參為研究對(duì)象,建立了丹參中多種酚酸類成分的一測(cè)多評(píng)分析方法,以丹參素鈉為內(nèi)參物,建立原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與丹參素鈉的相對(duì)校正因子,并進(jìn)行了方法學(xué)考察,結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法的實(shí)測(cè)值之間沒有顯著性差異,實(shí)驗(yàn)所得校正因子可信?？锲G輝等以黃連藥材為研究對(duì)象,以藥材中5個(gè)典型生物堿成分為指標(biāo),建立小檗堿與巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿的相對(duì)校正因子,并利用該校正因子計(jì)算其他成分的量(計(jì)算值),實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)。同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定藥材中該5種生物堿的量(實(shí)測(cè)值),并進(jìn)行方法學(xué)考察,比較發(fā)現(xiàn)計(jì)算值與實(shí)測(cè)值無顯著性差異,說明該方法可行、準(zhǔn)確。李文龍等為解決金銀花藥材分析中部分對(duì)照品價(jià)格高、不易獲得的問題,建立了一測(cè)多評(píng)的分析方法,通過測(cè)定綠原酸、咖啡酸與其他有機(jī)酸的相對(duì)校正因子,計(jì)算出其他幾種有機(jī)酸的量。該方法在不同實(shí)驗(yàn)室、不同型號(hào)的高效液相色譜儀以及不同色譜柱上進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)性滿意;與外標(biāo)法相比,所得結(jié)果均無顯著性差異。王瑞等建立了赤芍中2種不同類型共6個(gè)化學(xué)成分的一測(cè)多評(píng)定量方法,以芍藥苷為內(nèi)參物,建立其與芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酸、沒食子酸甲酯和五沒食子?；咸烟堑南鄬?duì)校正因子。同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定16批赤芍中6個(gè)成分的量,結(jié)果建立的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好,計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間無顯著差異。2.2測(cè)多評(píng)法確定不同品牌填料及不同長(zhǎng)度色譜柱的確定近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的多成分測(cè)定和多指標(biāo)質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)中。鄒桂欣等首次將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制中,以葛根素為指標(biāo),建立冠脈康膠囊中該成分與大豆苷元及丹酚酸B的相對(duì)校正因子,并用相對(duì)校正因子計(jì)算大豆苷元及丹酚酸B的量,同時(shí)對(duì)一測(cè)多評(píng)的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,并對(duì)不同品牌填料及不同長(zhǎng)度的色譜柱進(jìn)行考察,結(jié)果表明利用一測(cè)多評(píng)法在不同色譜柱的計(jì)算值與外標(biāo)實(shí)測(cè)值之間無顯著性差異,符合中藥的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式的要求。林永強(qiáng)等以綠原酸為指標(biāo),建立了銀黃片中6種咖啡先奎寧酸的一測(cè)多評(píng)定量測(cè)定方法,同時(shí)對(duì)13批銀黃片一測(cè)多評(píng)的計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,并對(duì)不同品牌儀器和不同廠家色譜柱進(jìn)行考察,結(jié)果表明,利用一測(cè)多評(píng)法在不同色譜柱的計(jì)算值與外標(biāo)實(shí)測(cè)值之間沒有顯著性差異。3實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)問題是數(shù)據(jù)采集和多評(píng)估3.1相對(duì)校正因子的影響在一測(cè)多評(píng)法建立的過程中,所有能引起檢測(cè)器響應(yīng)值變化的因素均有可能引起相對(duì)校正因子的波動(dòng)。不同實(shí)驗(yàn)室、不同型號(hào)的高效液相色譜儀、不同色譜柱以及流動(dòng)相的組成比例、pH值、柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等微小改變均會(huì)引起相對(duì)校正因子的改變,在實(shí)測(cè)值與計(jì)算值之間引入誤差。因此,在一測(cè)多評(píng)研究階段,應(yīng)充分考察不同因素對(duì)相對(duì)校正因子值的影響,對(duì)影響較大的因素進(jìn)行限定,以保證其具有良好的重現(xiàn)性。3.1.1多成分測(cè)定中的多成分分析一測(cè)多評(píng)法建立之后,各成分與內(nèi)參物之間的相對(duì)校正因子作為常數(shù),應(yīng)用于多成分測(cè)定中。但是不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員即使在同一色譜系統(tǒng)和檢測(cè)條件下,所測(cè)得的相對(duì)校正因子值也會(huì)有微小差異,故方法學(xué)建立時(shí)需考察不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員所引入的誤差是否在允許的范圍內(nèi)。3.1.2相對(duì)校正因子值檢測(cè)方法計(jì)算值與實(shí)測(cè)值之間的誤差除了檢測(cè)過程中的人為誤差和系統(tǒng)誤差外,還應(yīng)考慮分析儀器硬件所引起的誤差。一測(cè)多評(píng)法建立時(shí)多使用不同的色譜儀器系統(tǒng)檢測(cè),計(jì)算平均相對(duì)校正因子值,目前主要有Waters和Agilent公司生產(chǎn)的不同型號(hào)的高效液相色譜儀,少量有奧泰公司生產(chǎn)的色譜儀等。一測(cè)多評(píng)研究中,多使用紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器,少數(shù)使用紫外-可見光檢測(cè)器、紫外-電噴霧檢測(cè)器檢測(cè)器和通用型質(zhì)譜檢測(cè)器。對(duì)于紫外檢測(cè)器,根據(jù)待測(cè)成分的結(jié)構(gòu)特性選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)非常重要。為了兼顧多個(gè)成分的強(qiáng)吸收,并不能選擇各成分的最大吸收波長(zhǎng),因此測(cè)定誤差增大,且不同類型成分間的誤差比同類成分間的誤差大,不同儀器上表現(xiàn)也更明顯。3.1.3色譜條件優(yōu)化色譜檢測(cè)條件包括不同的檢測(cè)器類型、固定相種類、流動(dòng)相組成,是分析誤差來源需要考慮的主要因素。色譜柱主要是來自不同生產(chǎn)廠家的C18鍵合硅膠柱,不同色譜柱固定相粒度不同,色譜柱的長(zhǎng)短、內(nèi)徑不一,勢(shì)必會(huì)造成相對(duì)校正因子值的波動(dòng)。流動(dòng)相的組成、比例會(huì)影響色譜峰的分離度和峰參數(shù),從而引起誤差,但可以通過改善色譜系統(tǒng),優(yōu)化色譜條件將此偏差降至最低。另外,柱溫、體積流量的改變也會(huì)引起相對(duì)校正因子的微小波動(dòng)。3.2色譜峰的定位一測(cè)多評(píng)在實(shí)際應(yīng)用于定量測(cè)定時(shí),由于只有內(nèi)參物用到了對(duì)照品,其他待測(cè)成分無對(duì)照品,無法準(zhǔn)確確定待測(cè)組分峰(即目標(biāo)峰)的位置,因此,如何對(duì)這些成分的色譜峰進(jìn)行定位是一測(cè)多評(píng)法需解決的關(guān)鍵問題之一。文獻(xiàn)研究中對(duì)目標(biāo)峰的定位方法主要有2種:一是采用待測(cè)組分與內(nèi)參物的保留時(shí)間差值定位;二是根據(jù)待測(cè)組分與內(nèi)參物的相對(duì)保留時(shí)間比值定位,并結(jié)合色譜峰的形狀、化合物的紫外吸收特征、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)給出的質(zhì)譜信息等輔助確認(rèn)。也有對(duì)這兩種方法進(jìn)行考察,根據(jù)考察結(jié)果確定最合適的目標(biāo)峰定位方法,如果仍不能準(zhǔn)確定位可以使用含有上述待測(cè)成分中藥對(duì)照提取物進(jìn)行定位。4提高了檢測(cè)工作效率目前中藥化學(xué)對(duì)照品的種類和數(shù)量還不能滿足質(zhì)量檢測(cè)和新藥研發(fā)的需求,中藥及其制劑的質(zhì)量通常采用逐個(gè)檢測(cè)有效成分的方法來控制,檢測(cè)效率低。一測(cè)多評(píng)法實(shí)現(xiàn)了在對(duì)照品缺乏的情況下,進(jìn)行中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制,顯著降低了檢測(cè)成本,提高了工作效率。另外,有文獻(xiàn)報(bào)道用“替代對(duì)照品”法對(duì)中藥有效成分進(jìn)行測(cè)定,其原理與一測(cè)多評(píng)法基本一