一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定連翹中4種主要成分的含量

一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定連翹中4種主要成分的含量

關(guān)于一測(cè)多評(píng)價(jià)方法的研究理念已成功應(yīng)用于同一類型的組分的質(zhì)量評(píng)價(jià)。所包含的化合物包括肥皂、黃酮和堿性。所使用的藥物包括白木通、人參、三七、黃藥等。其中,黃連的一測(cè)多評(píng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已被2010年版《中國(guó)藥典》采納。本實(shí)驗(yàn)將以連翹為研究對(duì)象,深入探討不同類型化合物之間開(kāi)展一測(cè)多評(píng)研究的準(zhǔn)確性與可行性。連翹[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]為木犀科連翹屬落葉灌木,其果實(shí)入藥,具有清熱解毒、消腫散結(jié)功效,是一味常用中藥。一直以來(lái),包括2005年版《中國(guó)藥典》在內(nèi),都是以連翹苷作為連翹藥材的質(zhì)量控制指標(biāo),但近年來(lái)以抗菌、抗病毒活性成分連翹酯苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)的研究越來(lái)越多,并且2010年版《中國(guó)藥典》已確定將連翹酯苷作為質(zhì)量控制指標(biāo),鑒于多種原因,本版藥典沒(méi)能同步測(cè)定這兩種成分,另外,研究還發(fā)現(xiàn)蘆丁、連翹酯素亦是連翹中的主要成分,與連翹的臨床功效具有密切相關(guān)性。因此建立以連翹酯苷等多個(gè)有效成分為指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn),能更好地控制其質(zhì)量。然而主要有效成分連翹酯苷的穩(wěn)定性差、純化難度亦大,必將給未來(lái)的質(zhì)量控制帶來(lái)不便。為此本實(shí)驗(yàn)以結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉的蘆丁作為內(nèi)參物,采用一測(cè)多評(píng)來(lái)同步測(cè)定連翹中多個(gè)有效成分的含量,這樣不僅能大幅度降低檢測(cè)成本和時(shí)間,還能提高方法的實(shí)用性和更有效地控制藥材的質(zhì)量。1gc/ms測(cè)定譜柱、kramasil100-lWaters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng),Empower工作站(Waters公司);Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng),AgilentChemStation工作站;色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm);KQ-100超聲儀(40kW);乙腈為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純;蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹酯素均為實(shí)驗(yàn)室自制,其中蘆丁、連翹苷、連翹酯素純度均達(dá)98%以上,連翹酯苷A因其不穩(wěn)定,純度為97%以上;連翹藥材采購(gòu)自河南、陜西、山西、江西、江蘇等地,經(jīng)本所生藥室何希榮主管技師鑒定為木犀科植物連翹[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]的干燥果實(shí)。2分析和結(jié)果2.11個(gè)研究和多評(píng)價(jià)理論的研究2.1.1流動(dòng)相色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)。流動(dòng)相為乙腈-水(含0.3%冰醋酸),梯度洗脫程序見(jiàn)表1,流速0.8mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)275nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見(jiàn)圖1。2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定蘆丁為黃酮醇類,連翹酯苷A為苯乙醇苷類,連翹苷、連翹酯素為雙環(huán)氧木脂素類,4種目標(biāo)成分的全波長(zhǎng)紫外吸收見(jiàn)圖2,兼顧上述4個(gè)成分,選擇275nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。2.1.3混標(biāo)溶液的配制取蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹酯素4種對(duì)照品,精密稱定,依次為4.08,13.89,4.15,4.47mg,分別置于10mL量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度。精密移取上述4個(gè)對(duì)照品溶液各1mL,置于10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得混標(biāo)溶液。于4℃保存?zhèn)溆谩?.1.4濾過(guò)、吸光度的測(cè)定取連翹藥材粉末(過(guò)40目篩)約0.3g,精密稱定,置于50mL錐形瓶,精密加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇水溶液10mL,稱定,超聲30min,補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,用濾膜(0.22μm)濾過(guò),即得。2.1.5進(jìn)樣分析精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2,4,6,8,10μL,進(jìn)樣分析,每個(gè)濃度進(jìn)樣2次,取平均值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸,蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。2.1.6采用回歸因子計(jì)算以蘆丁為內(nèi)參物,按公式,計(jì)算連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素對(duì)蘆丁的相對(duì)校正因子,分別為0.559、0.696、0.837。2.1.7加樣回復(fù)突變?cè)囼?yàn)精密吸取同一供試品溶液10μL于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素的峰面積,得出日內(nèi)精密度的RSD分別為1.2%,0.7%,2.3%,3.5%;吸取同一供試品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣3d,每天3次,記錄以上4個(gè)成分的峰面積,得出日間精密度的RSD分別為2.9%,1.4%,2.7%,3.5%。表明儀器較為穩(wěn)定。2.1.8峰面積積分值精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48和72h測(cè)定峰面積積分值,蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素在3d內(nèi)峰面積的RSD分別為3.1%,1.4%,2.7%,3.5%。表明處理后的樣品在3d內(nèi)穩(wěn)定。2.1.9平均含量測(cè)定稱取同一批連翹(產(chǎn)地新鄉(xiāng))樣品的藥材粉末(40目),約0.3g共6份,精密稱定,按供試品溶液處理方法制備,測(cè)定蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素的平均含量分別為0.084%,0.41%,0.073%,0.052%,RSD分別為3.8%,4.7%,6.6%,5.2%。2.1.1加樣回收試驗(yàn)取0.15g已知含量的連翹藥材粉末(40目)5份,精密稱定,分別按各成分在藥材中的含量精密加入對(duì)照品溶液,相當(dāng)于蘆丁0.235mg,連翹酯苷A0.599mg,連翹苷0.103mg,連翹酯素0.073mg,按“2.1.4”方法制備樣品,測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素的加樣回收率分別為104.7%,99.8%,105.1%,100.6%,RSD分別為3.2%,2.6%,4.0%,2.7%。2.2重建因子的再現(xiàn)研究2.2.1聚酯的相對(duì)校正因子實(shí)驗(yàn)考察了Waters2695-2996、Agilent1100兩種高效液相色譜系統(tǒng),每種型號(hào)的儀器各兩臺(tái),考察了AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)兩種色譜柱。計(jì)算連翹酯苷、連翹苷、連翹酯素對(duì)蘆丁的相對(duì)校正因子依次在0.541～0.624,0.637～0.769,0.76～0.922;其中,不同儀器所得相對(duì)校正因子的RSD在5.2%～7.5%,同一儀器不同色譜柱所得相對(duì)校正因子的RSD在0.29%～6.9%。2.2.2不同品牌回收率和色譜柱的重現(xiàn)性知道蘆丁的保留時(shí)間,利用目標(biāo)成分對(duì)于蘆丁的相對(duì)保留時(shí)間,即可對(duì)峰進(jìn)行定位,考察此參數(shù)在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性,其中連翹酯苷A對(duì)蘆丁的相對(duì)保留時(shí)間在1.102～1.124,連翹苷的相對(duì)保留時(shí)間在2.195～2.306,連翹脂素的相對(duì)保留時(shí)間在3.334～3.701,RSD分別為0.66%、2.1%、4.6%。2.3蘆丁、麻黃酯苷a、麻黃酯素a、麻黃酯素a含量的比較分別精密吸取不同批次藥材供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定。采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算連翹藥材中蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷和連翹酯素的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。比較兩種方法所得到的含量值,其中連翹酯苷A的相對(duì)誤差在3.42%～4.29%,連翹苷的相對(duì)誤差在1.10%～1.90%,連翹脂素的相對(duì)誤差在0.75%～3.21%;表明兩種含量測(cè)定方法得到的含量值之間無(wú)顯著性差異,一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于連翹中不同類成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的。3流動(dòng)相系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.1由于連翹酯苷不穩(wěn)定,高溫易分解,實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取方法制備連翹藥材供試品溶液。在查閱文獻(xiàn)、借鑒前人研究基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度甲醇、乙醇、水作為提取溶劑進(jìn)行提取,結(jié)果以體積分?jǐn)?shù)70%甲醇作為溶劑,超聲提取,目標(biāo)成分提取率較高,分離度較好,干擾的雜質(zhì)峰較少,且方法簡(jiǎn)單,成本較低,故本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇超聲方法制備供試品溶液。3.2實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水,加入冰醋酸、磷酸鹽、四氫呋喃等流動(dòng)相系統(tǒng),及其不同比例洗脫系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙腈-水-冰醋酸的分離效果優(yōu),目標(biāo)峰達(dá)基線分離,且重復(fù)性好。流動(dòng)相中加入冰醋酸,可以改善分離效果,防止拖尾,使峰形尖銳、對(duì)稱。簡(jiǎn)化流動(dòng)相系統(tǒng)可提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。3.3本實(shí)驗(yàn)建立了連翹中不同類成分的一測(cè)多評(píng)法,同時(shí)檢測(cè)蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹酯素。連翹酯苷A、連翹苷為連翹中的特征性成分;考慮到連翹酯苷A穩(wěn)定性不好,純化難度大,對(duì)照品不易得到;而蘆丁對(duì)照品廉價(jià)易得且在連翹中含量較高,因此選擇蘆丁為內(nèi)參物,更能體現(xiàn)一測(cè)多評(píng)方法的簡(jiǎn)便、易操作、低成本。3.4本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為參照,根據(jù)目標(biāo)峰與內(nèi)參物峰之間的相對(duì)保留時(shí)間,結(jié)合各峰的紫外吸收特征、峰形等信息,即能夠正確判斷出各目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置,由此表明,利用上述方法進(jìn)行峰的定位是可行的。3.5蘆丁為黃酮醇類,連翹酯苷為苯乙醇苷類,連翹苷、連翹酯素為雙環(huán)氧木脂素類,為兼顧4個(gè)成分的吸收強(qiáng)度和吸收峰的平穩(wěn)程度,選擇275nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。3.6建立連翹中不同類成分的相對(duì)校正因子評(píng)價(jià)過(guò)程中,我們考察了不同色譜柱、不同液相色譜儀器影響,結(jié)果表明,與同類成分間相對(duì)校正因子的RSD值比較,不同類成分間相對(duì)校正因子的RSD偏大