奶牛性控凍精技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

奶牛性控凍精技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

牛的性別由性染色體決定。在生產(chǎn)中人們希望母牛多產(chǎn)母犢以加快奶牛群的擴(kuò)繁速度和提高牛群的產(chǎn)奶量,因此對奶牛性別控制的研究就成為了奶牛繁殖科研工作者所關(guān)心的課題。奶牛性控凍精人工授精技術(shù)是將奶牛種公牛的精子通過精子分離儀使含X、含Y染色體精子得到有效的分離,將分離后得到的X精子進(jìn)行分裝冷凍制成凍精細(xì)管,進(jìn)行奶牛的人工授精,從而使母牛懷孕產(chǎn)母犢的技術(shù)。根據(jù)有關(guān)專家的研究結(jié)果進(jìn)行綜合分析,采用性控凍精進(jìn)行人工授精,奶牛情期受胎率為54.36%,比常規(guī)凍精受胎率(67.27%)低;使用性控凍精的青年牛受胎率(62.27%)比經(jīng)產(chǎn)牛(39.40%)明顯要高,母犢率為93.23%;使用性控凍精超排胚胎與常規(guī)凍精相比獲得胚胎的數(shù)量和質(zhì)量相近,鑒定胚胎雌性比例試驗(yàn)數(shù)據(jù)不低于92.98%,移植后可得到較高的懷孕率。奶牛性控凍精人工授精技術(shù)的應(yīng)用對于增加奶牛數(shù)量和提高奶牛種群質(zhì)量等具有重要意義,有著良好的應(yīng)用前景。1精子分離技術(shù)從1902年McClung提出性別決定理論之后,對于性別決定有了劃時代的突破。1910年,Guyer首次發(fā)現(xiàn)了性染色體。20世紀(jì)60年代流式細(xì)胞儀誕生,人們利用精子染色體DNA作為一種標(biāo)記來分離哺乳動物X、Y精子的研究也從此逐漸展開。1989年,Johnson等用流式細(xì)胞儀成功地分離兔子活的X和Y精子,并通過人工授精得到兔子后代,雄性準(zhǔn)確率為81%、雌性為94%。1993年,英國劍橋動物生物有限公司開展分離牛精子體外受精研究獲得成功,性別準(zhǔn)確率均達(dá)到100%。在1997~1999年間,美國人Seidel等做了分離公牛精子人工授精試驗(yàn),所獲得的懷孕率、產(chǎn)犢情況、初生重以及隨后的生長發(fā)育與對照組的結(jié)果沒有顯著差別,產(chǎn)下犢牛的性別準(zhǔn)確率X精子為83%,Y精子為90%。精子分離技術(shù)已申請專利保護(hù),美國X、Y公司在1997年獨(dú)家買斷動物精子分離技術(shù)專利。英國Cogent公司是世界上第一家將分離技術(shù)投入生產(chǎn)的公司,到2000年7月為止,該公司在其屬下的162個農(nóng)場對2000頭牛進(jìn)行了人工授精,分離精子的平均懷孕率為52%,而非分離精子對照組為56%。中國分離精子研究起步較晚,但發(fā)展非常迅速。廣西大學(xué)在2002年購入一臺流式細(xì)胞儀,率先在國內(nèi)開展了分離精子性別控制的研究。中國種畜進(jìn)出口公司于2004年買入動物精子分離專利技術(shù)。到2006年,國內(nèi)已有3家性控凍精生產(chǎn)廠家,這些單位應(yīng)用美國X、Y公司的流式細(xì)胞儀(X、Y精子分離儀)生產(chǎn)的奶牛性控凍精,在中國進(jìn)行了大量的性控凍精人工授精、生產(chǎn)體內(nèi)和體外性控胚胎、性控胚胎移植等試驗(yàn),取得了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù),為我國家畜的性控繁育奠定了基礎(chǔ)。2精子分離方法X、Y精子之間存在某些差異,如X、Y精子頭部大小、重量和比重、外膜電荷、運(yùn)動速度的差異等,人們可利用這些差異分離X、Y精子。目前,精子分離方法主要是“物理分離法”,包括流式細(xì)胞光度計法、免疫法、沉淀法、電泳法、離心法?，F(xiàn)在生產(chǎn)中主要使用流式細(xì)胞儀分離X、Y精子。流式細(xì)胞光度計法是當(dāng)前分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法,其理論基礎(chǔ)是:X精子的DNA含量比Y精子的高。對于牛,X精子比Y精子DNA含量高3.80%。DNA特異性染料著色量與精子DNA含量成正比,因此,X精子吸收的染料就多,X精子發(fā)出的熒光較強(qiáng)。具體的做法是:先用DNA特異性染料對精子進(jìn)行活體染色,然后精子連同少量稀釋液逐個通過激光束,探測器根據(jù)精子的發(fā)光強(qiáng)度把電子信號傳遞給計算機(jī),計算機(jī)指令液滴充電使發(fā)光強(qiáng)度高的液滴帶正電,弱的帶負(fù)電。即X精子帶上正電荷,Y精子帶上負(fù)電荷。當(dāng)X精子和Y精子經(jīng)過高壓電場時會向不同方向偏轉(zhuǎn),達(dá)到分離的目的,用分離后的精子進(jìn)行人工授精或?qū)κ芫押秃蟠男詣e進(jìn)行控制。此法具有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性的特點(diǎn),分離準(zhǔn)確率高達(dá)90%。3關(guān)于牛性控制冷精人工的應(yīng)用效果的研究3.1青年酵母的受胎情況王建國等試驗(yàn)表明:應(yīng)用奶牛性控凍精人工授精母牛的情期受胎率為59.4%(342/576),其中青年牛為65.6%(240/366)、經(jīng)產(chǎn)牛為48.6%(102/210)),同期普通凍精為60.6%(129/213);性控凍精人工授精的母牛后代母犢率為93.3%(319/342),普通凍精為48.8%(63/129)。呂自力等在2005~2007年對國內(nèi)不同地區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計,青年母牛和成年母牛情期的受胎率平均為63%(1087/1725),而統(tǒng)計青年母牛(15~17月齡)達(dá)到77.5%(213/275);性控凍精人工授精的母牛出生母犢率為93%(960/1032)。李怡等試驗(yàn)表明,性控凍精青年牛受胎率為64.9%(734/1131),常規(guī)凍精為68.9%(645/936),利用B超儀對性控凍精授精的68頭妊娠55~90天的母牛胎兒進(jìn)行了性別鑒定,母犢率為94.1%(64/68)。筆者對相關(guān)文獻(xiàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,性控凍精人工授精平均受胎率為54.36%(3358/6177),比常規(guī)凍精的67.27%(814/1214)略低,使用性控凍精青年母牛的受胎率為62.27%(1652/2653),明顯高于經(jīng)產(chǎn)母牛的39.40%(764/1939),使用性控凍精獲得的母犢率為93.23%(2368/2540)[8~9]。與李蘭東等報道的2005年以來全國應(yīng)用性控凍精授精的情期受胎率在50%以上(58%~77%)結(jié)果相一致,也與王振斌等報道的2000年美國XY公司應(yīng)用奶牛性控凍精給10787頭奶牛進(jìn)行人工授精情期受胎率達(dá)到53%、青年母牛達(dá)60%以上,母犢率達(dá)到了93%的結(jié)果相一致,說明目前我國的性控凍精人工授精技術(shù)水平已基本成熟,達(dá)到了國際先進(jìn)水平,在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用沒有太大的技術(shù)難題。3.2不同的存活時間王建國等對奶牛性控凍精與普通凍精解凍后在37℃水浴鍋中存活時間進(jìn)行檢測試驗(yàn),結(jié)果奶牛X性控凍精存活時間為5~12小時,比同種普通精子的存活時間短2~10小時。梁小軍等試驗(yàn)表明:性控凍精解凍后活力為0.50,在38℃厭氧環(huán)境下,存活時間為6小時,比普通凍精低7小時。由此可以看出,性控凍精解凍后精子的存活時間比常規(guī)凍精短2~10小時,這就要求在進(jìn)行人工授精時把握好輸精的準(zhǔn)確時間。3.3復(fù)輸藥物期間情期受胎率及輸精時間王建國等試驗(yàn)表明:在母牛發(fā)情結(jié)束后6~8小時左右進(jìn)行人工授精,其情期受胎率為67.1%,顯著高于在母牛發(fā)情開始后8~12小時進(jìn)行人工授精(56.1%)的情期受胎率(P<0.01)。在確定母牛卵泡發(fā)育的前提下,將精液全部輸至發(fā)育側(cè)子宮角大彎處,其情期受胎率為62.7%,高于母牛每側(cè)子宮角輸1/2支X性控凍精(46.1%)的情期受胎率,但二者之間差異不顯著(P<0.05)。梁小軍等試驗(yàn)表明:選擇適宜的輸精時間(發(fā)情結(jié)束后的2~4小時,或比常規(guī)輸精時間晚4~6小時),實(shí)施子宮角深部輸精,累計配種良種青年母牛348頭,60天妊檢受孕261頭,受胎率為75.0%。從以上結(jié)果可以看出,只要技術(shù)人員正確掌握好奶牛性控凍精人工授精技術(shù),把握好輸精部位和輸精時間,其受胎率與使用常規(guī)凍精差別不大。3.4人工感染性控凍精的實(shí)現(xiàn)方式李怡等試驗(yàn)表明:使用常規(guī)凍精對49頭牛進(jìn)行超排,頭均可用胚胎為5.5枚,可用胚胎率為56.0%;使用性控凍精對50頭牛進(jìn)行超排,頭均可用胚胎為4.6枚,可用胚胎率為49.0%,兩者的差異不顯著(P>0.05)。呂自力等在2005~2007年對不同地區(qū)的168頭供體母牛采用性控凍精輸精后共獲得793枚可用胚胎,頭均可用胚胎4.72枚,性控胚胎用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定后的性控比率是雌性比92.98%(53/57)。黃河等應(yīng)用性控凍精對75頭超排供體母牛進(jìn)行輸精,共采集胚胎633枚,其中可用胚胎339枚,退化胚胎135枚,未受精卵159枚。胚胎的受精率為74.9%(474/633),可用率為53.6%,發(fā)育率為71.5%,頭均獲得可用胚胎4.5枚。應(yīng)用LAMP法對61枚胚胎進(jìn)行性別鑒定后,確定雌性胚胎比例為1∶1(61/61)。11枚性控凍精生產(chǎn)的體內(nèi)性控冷凍胚胎移植后,懷孕率為63.6%。因此,應(yīng)用性控凍精對供體母牛進(jìn)行輸精,不僅可獲得與常規(guī)凍精輸精后相接近的胚胎數(shù)量和質(zhì)量,鑒定胚胎雌性比例高(上述數(shù)據(jù)不低于92.98%),而且移植后可得到較高的懷孕率。應(yīng)用性控凍精生產(chǎn)體內(nèi)性控胚胎,可在我國胚胎移植技術(shù)中大量推廣應(yīng)用。4在中國的非點(diǎn)源控制和冷凍技術(shù)的推廣方案和解決措施中4.1加大宣傳,強(qiáng)化農(nóng)民對性控凍精的學(xué)習(xí)X、Y精子分離技術(shù)是近年來走向生產(chǎn)的,分離出的X精子比例達(dá)90%以上,存在性控凍精細(xì)管每劑量含有效精子數(shù)少(目前生產(chǎn)的0.25毫升細(xì)管型性控凍精200萬~240萬個/支,常規(guī)凍精≥1000萬個/支)、解凍后精液活力低等情況,有的人就擔(dān)心使用性控凍精進(jìn)行人工授精受胎率低、產(chǎn)生弱胎和畸形胎、遺傳品質(zhì)不佳等,這需要加大性控繁育的宣傳力度,加強(qiáng)養(yǎng)殖戶對性控凍精知識的學(xué)習(xí)了解,對奶牛配種技術(shù)人員加大人工授精技術(shù)操作培訓(xùn)工作。從目前應(yīng)用性控凍精的效果來看,只要技術(shù)人員真正掌握性控凍精人工授精技術(shù),使用性控凍精的奶牛受胎率與使用常規(guī)凍精差別不大。4.2嚴(yán)格控凍和輸精在使用性控凍精進(jìn)行奶牛人工授精中,有些地方反映受胎率低及出現(xiàn)爆管現(xiàn)象,這主要是因?yàn)檫x擇受配母牛不當(dāng)、奶牛健康或體況不佳、配種時間掌握不準(zhǔn)確、解凍技術(shù)操作不當(dāng)、發(fā)情鑒定不準(zhǔn)確、授精技術(shù)不當(dāng)?shù)仍蛟斐?。?yīng)首選營養(yǎng)狀況良好、生殖系統(tǒng)發(fā)育正常、無繁殖障礙性疾病、父母代均為高產(chǎn)奶牛的青年母牛作為受配母牛。嚴(yán)格人工授精技術(shù)操作規(guī)范,認(rèn)真做好奶牛發(fā)情鑒定,正確進(jìn)行性控凍精細(xì)管的解凍,嚴(yán)格進(jìn)行輸精前的清洗消毒,熟練掌握輸精技術(shù),把握好輸精部位,做到適時輸精。認(rèn)真對待性控凍精人工授精工作的每一個細(xì)節(jié),減少技術(shù)失誤,從而提高其受胎率。4.3使用優(yōu)質(zhì)性控凍精目前優(yōu)質(zhì)奶牛性控凍精細(xì)管在100~300元/支,常規(guī)凍精僅為每支幾十元,性控凍精價格較高,牛場使用謹(jǐn)慎,推廣應(yīng)用緩慢。然而,使用優(yōu)質(zhì)性控凍精細(xì)管的后代母犢率在90%以上,并且后代生產(chǎn)性能良好。從牛場的長期利益考慮,使用性控凍精可減少公犢出生比例,提高牛群質(zhì)量,加快繁育速度,遠(yuǎn)遠(yuǎn)比使用常規(guī)凍精劃算。只要配種技術(shù)人員技術(shù)過硬,使用性控凍精的受胎效果比常規(guī)凍精相差不大。奶牛場應(yīng)積極推廣性控凍精人工授精技術(shù),可采用在標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模奶牛場試點(diǎn),以點(diǎn)帶面、示范帶動等方式,擴(kuò)大性控凍精人工授精的覆蓋面,增加社會的整體效益。5牛奶冷凍技術(shù)的應(yīng)用前景5.1優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)牛奶可增強(qiáng)量降目前我國奶業(yè)和奶牛業(yè)正處于發(fā)展階段,奶制品和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛都存在嚴(yán)重的缺口。2007年底,奶牛存欄1200萬頭,成年奶牛平均單產(chǎn)3.8噸,人均占有鮮奶20千克,僅為世界人均占有量(95千克)的1/5,與世界發(fā)達(dá)國家人均占有鮮奶140千克相比差距甚遠(yuǎn)。隨著我國國民收入的增加,對牛奶的需求也逐年增加,從而促進(jìn)了奶牛業(yè)的發(fā)展。采用優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的奶牛性控凍精進(jìn)行人工授精,奶牛產(chǎn)母犢率可達(dá)到90%以上,極大縮短了奶牛世代間隔時間,使奶牛擴(kuò)繁速度加快;同時優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛性控凍精的使用,使奶牛的整體生產(chǎn)性能提高。這對我國高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛的擴(kuò)繁具有極大的推動作用,在我國具有良好的應(yīng)用前景。5.2經(jīng)濟(jì)效益分析優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛性控凍精人工授精技術(shù)的應(yīng)用降低了公犢的自然出生比例,減少了牛場飼養(yǎng)奶牛公牛犢的經(jīng)濟(jì)支出和人員的浪費(fèi)。同時優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的奶牛價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般的低產(chǎn)奶牛,高產(chǎn)奶牛的產(chǎn)奶量可以達(dá)到年產(chǎn)8~9噸,也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低產(chǎn)奶牛(年產(chǎn)3~4噸),二者經(jīng)濟(jì)效益相比相差甚遠(yuǎn)。因此奶牛性控凍精人工授精技術(shù)的應(yīng)用可以增加奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。5.3將性控凍精人工授成經(jīng)濟(jì)增長效應(yīng)同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植、生物基因工程技術(shù)、細(xì)胞克隆技術(shù)等一系列技術(shù)的研究日益成熟,在奶牛生產(chǎn)繁殖中逐步得到應(yīng)用,若在生產(chǎn)中與性控凍精