酶工程 第四章 酶的提取與分離 2013-3-苗條

酶工程

EnzymeEngineering林范學(xué)

fanxuelin@1第四章酶的提取與分離酶的提取（extraction）與分離（separation，isolation）純化（purification）是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得所要求的酶制品的過(guò)程。主要內(nèi)容包括細(xì)胞破碎，酶的提取，離心分離，過(guò)濾與膜分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，濃縮，干燥、結(jié)晶等2酶分離純化路線(xiàn)細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。3第一節(jié)細(xì)胞破碎celldisruption胞外酶：細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生以后，可以分泌到細(xì)胞外的酶胞內(nèi)酶：合成以后不分泌到細(xì)胞外，仍然存于細(xì)胞內(nèi)的酶溶酶：游離在細(xì)胞內(nèi)結(jié)酶：牢固與膜或細(xì)胞顆粒結(jié)合在一起不同類(lèi)型細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞多為——胞外酶植物細(xì)胞多為——胞內(nèi)酶微生物細(xì)胞為——胞外酶、胞內(nèi)酶4胞外酶提?。蝴}析、沉淀等從發(fā)酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞內(nèi)酶提?。菏占w，破碎細(xì)胞后提取。結(jié)酶：打斷酶蛋白和細(xì)胞顆粒結(jié)合。動(dòng)物細(xì)胞需剔除結(jié)締組織、脂肪組織等植物材料如種子應(yīng)去殼，以免單寧等物質(zhì)著色污染。5細(xì)胞破碎方法及其原理分類(lèi)破碎方法原理機(jī)械破碎法搗碎法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，使細(xì)胞破碎添加表面活性劑酶促破碎法自溶法通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，達(dá)到細(xì)胞破碎外加酶制劑法6一、機(jī)械破碎法方法作用過(guò)程適用范圍搗碎法搗碎機(jī)高速旋轉(zhuǎn)葉片產(chǎn)生剪切力，將組織細(xì)胞破碎動(dòng)物內(nèi)臟，植物葉芽等脆嫩組織，細(xì)菌細(xì)胞研磨法研缽、石磨、細(xì)菌磨、球磨等研磨器械產(chǎn)生的剪切力，將組織細(xì)胞破碎微生物細(xì)胞、植物組織細(xì)胞勻漿法勻漿器產(chǎn)生的剪切力，將組織細(xì)胞破碎破碎程度高，用于易分散、較柔軟、顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞7二、物理破碎法方法作用過(guò)程適用范圍溫度差破碎法溫度突然變化，由于熱脹冷縮作用而使細(xì)胞破碎較脆弱、易破碎的細(xì)胞壓力差破碎法高壓沖擊；突然降壓；滲透壓變化G－菌，膜結(jié)合酶、細(xì)胞間質(zhì)酶。對(duì)G＋不適用超聲波破碎法聲波或超聲波的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用而使細(xì)胞破碎微生物細(xì)胞Ultra-highPressureCellDisrupter超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)8三、化學(xué)破碎法方法試劑作用過(guò)程有機(jī)溶劑甲苯、丙酮、丁醇、氯仿破壞細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)，改變膜透性，使胞內(nèi)酶等釋放到胞外，低溫下進(jìn)行防止酶失活表面活性劑Triton、吐溫與膜中磷脂及脂蛋白作用而破壞膜結(jié)構(gòu)，從而增加膜的透過(guò)性。一般采用非離子型，離子型會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)。9四、酶促破碎法方法試劑作用過(guò)程自溶法細(xì)胞自身的酶系在一定的pH值、溫度和離子強(qiáng)度下，細(xì)胞本身的酶系作用使細(xì)胞破壞，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)外加酶制劑法溶菌酶(G＋)；β-葡聚糖酶(酵母)；幾丁質(zhì)酶(霉菌)；纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶(植物細(xì)胞)破壞肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵(G＋)；水解β-1,3-葡聚糖(酵母)10第二節(jié)提取extraction酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┲械倪^(guò)程。也稱(chēng)為酶的抽提。提取目標(biāo)：

a.將目的酶最大限度地溶解出來(lái)。

b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則 a.相似相溶。（極性物質(zhì)：極性溶劑，非極性物質(zhì)：非極性溶劑，酸性物質(zhì)：堿性溶劑，堿性物質(zhì)：酸性溶劑） b.遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。11一、酶提取的方法提取方法使用的溶劑(液)提取對(duì)象鹽溶液提取0.02–0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2-6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8-12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含較多非極性基團(tuán)的酶四稀：稀酸、稀堿、稀鹽、稀有機(jī)溶劑，水。12二、影響酶提取的主要因素1、溫度溫度↑，酶的溶解度↑，酶分子的擴(kuò)散速度↑溫度過(guò)高，酶容易變性失活提取時(shí)溫度不宜過(guò)高。有機(jī)溶劑提取時(shí)，溫度在0~10℃。有些酶對(duì)溫度的耐受性較高，如酵母醇脫氫酶、細(xì)菌堿性磷酸梅、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些溫度下提取 在不影響酶的活性的條件下，適當(dāng)提高溫度，有利于酶的提取。132、pH值溶液的pH值對(duì)酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著的影響為了增加酶的溶解度，提取時(shí)溶液的pH值應(yīng)該遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)但是除了酸溶液提取或堿溶液提取者以外，提取時(shí)溶液的pH值不宜過(guò)高或過(guò)低，以防止酶的變性失活143、提取液的體積提取液↑，提取率↑過(guò)量的提取液，使酶濃度降低，對(duì)進(jìn)一步的分離純化不利提取液的用量一般為含酶原料體積的3～5倍。分次提取適當(dāng)攪拌加保護(hù)劑（底物，輔酶，抗氧化劑等）15第三節(jié)沉淀分離定義：沉淀分離就是改變某些條件或者加入某些物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。16沉淀分離主要方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離17一、鹽析沉淀法簡(jiǎn)稱(chēng)鹽析法，是利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離的過(guò)程。應(yīng)用最早、至今廣泛使用主要用于蛋白類(lèi)酶的分離純化。181、基本原理（鹽溶和鹽析）向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：

低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：

高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。19Neutral

salt

0.5-1.0M

usually

salting

inNeutral

salt

>

1M

will

salting

out

20原因：加入少量鹽↑，蛋白質(zhì)上極性基團(tuán)↑，蛋白質(zhì)溶解度↑：鹽溶。高鹽濃度，鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱(chēng)分段鹽析。2122232、溶解度影響因素酶在溶液中的溶解度與溶液的離子強(qiáng)度關(guān)系密切，可表示為：S：酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度（g/L）；S0：酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)（即在純?nèi)軇┲校┑娜芙舛龋╣/L）；KS：鹽析系數(shù)；I：離子強(qiáng)度。24在溫度和pH值一定的條件下，S0為一常數(shù)。β=lgS0，主要決定于酶或蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溫度和pH值有關(guān)。當(dāng)溫度和pH值一定時(shí)，β為一常數(shù)。Ks為鹽析系數(shù)，主要決定于鹽的性質(zhì)。其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。

25某酶或蛋白質(zhì)，在溫度和pH值等鹽析條件及所使用的鹽確定（即β、Ks確定）之后，酶或蛋白質(zhì)的溶解度決定離子強(qiáng)度I。離子強(qiáng)度I：指溶液中離子強(qiáng)弱的程度，與離子濃度和離子價(jià)數(shù)有關(guān)。即：mi——離子濃度（mol/L）;zi

——離子價(jià)數(shù)。26例如，0.2mol/L的（NH4）2SO4溶液，其中，銨離子濃度為2×0.2mol/L，價(jià)數(shù)為十1；硫酸根離子濃度為0.2mol/L，價(jià)數(shù)為十2；其離子強(qiáng)度為：273、分段鹽析Ks分段鹽析：在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），根據(jù)不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過(guò)改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值)使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。β分段鹽析：在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（I為常數(shù)），通過(guò)改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出284、鹽的選擇常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等硫酸銨溶解度大25℃時(shí)，溶解度為767g/L；在0℃時(shí)，溶解度為697g/L）不影響酶的活性分離效果好價(jià)廉易得29鹽濃度的表示飽和度例如，70mL酶液加入30mL飽和硫酸銨溶液，則混合溶液中硫酸銨的飽和度為30/（30十70）＝0.3。飽和硫酸銨溶液的配制方法：在水中加入過(guò)量的固體硫酸銨，加熱至50~60℃，保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去過(guò)量未溶解的硫酸銨，濾液在0℃或25℃平衡1~2天，有固體析出，此溶液即為飽和硫酸銨溶液，其飽和度為1。在鹽析過(guò)程中，需要加入的飽和硫酸銨溶液的體積，可以從有關(guān)文獻(xiàn)中直接查表獲得所需的數(shù)據(jù)。

30調(diào)整鹽濃度的方式飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。V,V0——分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積S2,S1——分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來(lái)溶液的硫酸銨飽和度31b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來(lái)體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。32調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表335、鹽析法影響因素1)離子強(qiáng)度和種類(lèi)鹽析方程：2)蛋白質(zhì)濃度：過(guò)稀回收沉淀困難，過(guò)濃易共沉淀，2.5%—3%最好。3)pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4)溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。一般可在室溫下進(jìn)行。某些對(duì)溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。34二、等電點(diǎn)沉淀法(isoelectricprecipitation)

1、原理等電點(diǎn)(isoelectricpoint，IEP，pI)

：在某一pH的溶液中，蛋白質(zhì)或氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱(chēng)為該氨基酸的等電點(diǎn)。非等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)自身所帶的電荷與水分子形成了雙電子層，使蛋白質(zhì)膠體互相排斥。pI時(shí)，蛋白質(zhì)的靜電荷為0，破壞了這種雙電層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集在一起，從而形成大顆粒沉淀出來(lái)。35等電點(diǎn)沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱(chēng)為等電點(diǎn)沉淀法。2、使用方法常與其他方法一起使用。單獨(dú)使用時(shí)，主要是用于從粗酶中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。加酸堿時(shí)，邊攪邊加，防止局部過(guò)酸過(guò)堿。36三、有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑(organicsolvent)，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱(chēng)為有機(jī)溶劑沉淀法(organicsolventprecipitation)。仙人掌茶加入丙酮出現(xiàn)蛋白質(zhì)類(lèi)似物沉淀蛋清凝固效果371.沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)，使分子間的靜電引力增大，易于凝結(jié)；使某些分子表明水膜破壞，溶解度降低。2.常用有機(jī)溶劑丙酮

乙醇

甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。383.影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度：低溫(0℃)操作，溶劑要預(yù)冷(-15~-20℃)（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/mL394.優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)1）分辨率比鹽析法高2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。40四、復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使其與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱(chēng)為復(fù)合沉淀法。常用的復(fù)合沉淀劑非離子型聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺(PEI)、單寧酸、硫酸鏈霉素離子型表面活性劑：SDS

優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。41五、選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，這種分離方法稱(chēng)為選擇性變性沉淀法。熱變性加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。如熱穩(wěn)定性好的α-淀粉酶。pH變性目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的pH使雜蛋白變性沉淀。有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。42第四節(jié)離心分離離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。一、離心機(jī)的選擇二、離心方法的選擇三、離心條件的確定43一、離心機(jī)的選擇44一、離心機(jī)的選擇45一、離心機(jī)的選擇46一、離心機(jī)的選擇1、常速離心機(jī)（低速離心機(jī)）：＜8000r/min分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)按纸Y(jié)晶等較大顆粒。472、高速離心機(jī)：1000~25000r/min用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片及較大的細(xì)胞器等。483、超速離心機(jī)：25000~120000r/min制備用超速離心機(jī)：分離純化生物大分子、細(xì)胞器和病毒等。分析用超速離心機(jī)：測(cè)定樣品純度、沉降系數(shù)、相對(duì)分子量49機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)裝置轉(zhuǎn)子、離心管、離心管帽冷凍裝置真空系統(tǒng)50離心機(jī)基本組件1.低速離心機(jī)

轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)最高轉(zhuǎn)速在8000rpm以下實(shí)驗(yàn)室中常用于分離制備。

2.高速離心機(jī)

系列轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)溫控系統(tǒng)最高轉(zhuǎn)速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分離制備

3.超速離心機(jī)系列轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)溫度控制真空系統(tǒng)常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子。51二、離心方法的選用常速、高速離心機(jī)：顆粒大小和密度相差較大，確定離心速度和時(shí)間分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，采用差速離心法超速離心機(jī)：差速離心密度梯度離心等密梯度離心521．差速離心（differentialcentrifugation）是指采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）沉降的顆粒受到擠壓，容易結(jié)團(tuán)，甚至失活。53541000g/10min去掉上清3000g/10minetc.55操作時(shí)，將均勻的懸浮液裝進(jìn)離心管，選擇好離心速度（離心力）和離心時(shí)間，使大顆粒沉降；分離出大顆粒沉淀后，再將上清液在加大離心力的條件下進(jìn)行離心，分離出較小的顆粒；如此離心多次，使不同沉降速度的顆粒分批分離出來(lái)。562．密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。

57密度梯度系統(tǒng)梯度介質(zhì)足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍；不會(huì)與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)；也不會(huì)引起樣品中組分的凝集、變性或失活。介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度蔗糖：濃度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm2

甘油密度屏障不連續(xù)梯度

連續(xù)梯度58密度梯度的制備梯度混合器

貯藏室

混合室BA59密度梯度混合器操作1、稀溶液置于B室，濃溶液置于混合室B，保持液面平等2、開(kāi)動(dòng)攪拌器3、同時(shí)打開(kāi)兩閥門(mén)4、離心管收集注意：1、若濃溶液置于B室，稀溶液置于A室，則梯度液導(dǎo)流管須插入離心管底部，讓后流入的高濃度混合液將先流入的低濃度的混合液頂起來(lái)。2、若離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)由于顆粒的擴(kuò)散作用，會(huì)使區(qū)帶變寬，影響離心效果，可適當(dāng)增加離心力縮短離心時(shí)間加以解決60A=B截面積B＞A濃度體積B＜A線(xiàn)性梯度凸形梯度凹形梯度61密度梯度混合器62手動(dòng)混合將不同濃度的蔗糖溶液，小心地一層層加入離心管中，越靠管底，濃度越高，形成階梯梯度。63操作過(guò)程注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過(guò)程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。50000rpm×15min50000rpm×20minSTOP643．等密度梯度離心(equilibrium-densitygradientcentrifugation)當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏巷h浮，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就可以一直移動(dòng)到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶。這種方法稱(chēng)為等密度梯度離心，或稱(chēng)為平衡等密度離心。isopycnic

centrifugation65特點(diǎn)：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)介質(zhì)氯化銫（CsCl）,硫酸銫（CsSO4）、溴化銫（CsBr）等。有時(shí)采三碘苯的衍生物。66操作過(guò)程先把一定濃度的銫鹽溶液與樣品液混合均勻，也可將一定量的銫鹽加到樣品液中使之溶解。在選定的離心力作用下，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間的離心分離。銫鹽在離心力的作用下，在離心力場(chǎng)中沉降，自動(dòng)形成密度梯度。樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點(diǎn)位置上形成區(qū)帶。67注意：

預(yù)先配置介質(zhì)的密度梯度溶液，將介質(zhì)和預(yù)分離樣品混合或者是置于梯度溶液頂部。離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)（即平衡點(diǎn)）的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。一旦達(dá)到了平衡，再延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變粒子的成帶位置。艷鹽對(duì)鋁合金的轉(zhuǎn)子有很強(qiáng)的腐蝕作用，要防止艷鹽溶液濺到轉(zhuǎn)子上,最好采用鉆合金轉(zhuǎn)子。

68密度梯度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降樣品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同69總結(jié)：差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。70三、離心條件的確定離心分離的效果好壞受到多種因素的影響離心機(jī)的種類(lèi)、離心方法、離心介質(zhì)以及密度梯度離心力（或離心速度）和離心時(shí)間。離心介質(zhì)的pH值和溫度。711．離心力（centrifugalforce）離心力（Centrifugalforce，F(xiàn)c）：指由于物體旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生脫離旋轉(zhuǎn)中心的力，取決于顆粒的質(zhì)量和離心加速度ac

ac:顆粒旋轉(zhuǎn)的加速度（m/s2）;ω:旋轉(zhuǎn)角速度(弧度／秒);r:顆粒離旋轉(zhuǎn)軸的距離，即旋轉(zhuǎn)半徑(cm);m:顆粒質(zhì)量（g）;n：轉(zhuǎn)速，單位為轉(zhuǎn)/分(r/min);

ρ:顆粒密度;V:物體體積72相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF

）即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字

g）表示。g為重力加速度（980.7cm/sec2)7374沉降系數(shù)（sedimentationconstant）指單位離心力下顆粒的沉降速度,用S表示。對(duì)于某一具體的顆粒，S是定值。(1S=10-13秒）常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。752．離心時(shí)間常速離心、高速離心和差速離心沉降時(shí)間：是指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時(shí)間。沉降時(shí)間決定于顆粒的沉降速度和沉降距離。密度梯度離心 區(qū)帶形成時(shí)間：指形成界限分明的區(qū)帶的時(shí)間。等密度梯度離心平衡時(shí)間：指顆粒完全達(dá)到等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間。76知道沉降系數(shù)的顆粒，其沉降時(shí)間為：t——沉降時(shí)間（s）；S—顆粒的沉降系數(shù)（s）；ω——轉(zhuǎn)子角速度（船以s）；r1——旋轉(zhuǎn)軸中心到樣品液液面的距離（cm）r2——旋轉(zhuǎn)軸中心到離心管底的距離（cm）。77效率因子K：是轉(zhuǎn)頭的一個(gè)特性指標(biāo)，可以衡量轉(zhuǎn)頭離心效率的高低.離心機(jī)出廠時(shí)標(biāo)出最大轉(zhuǎn)速時(shí)的K值?？梢愿鶕?jù)公式計(jì)算出其他轉(zhuǎn)速時(shí)的K值。78離心機(jī)r1、r2為定值，某一顆粒的沉降系數(shù)S為定值，即ω2t為定值，得較高轉(zhuǎn)速+較短時(shí)間較低轉(zhuǎn)速+較長(zhǎng)時(shí)間793．溫度和PH值離心溫度4℃左右，某些耐熱性較好的酶，室溫（20~25℃）。在超速離心和高速離心時(shí)，必須采用冷凍系統(tǒng)。離心介質(zhì)的pH處于酶穩(wěn)定的pH值范圍可用緩沖溶液。80第五節(jié)過(guò)濾與膜分離過(guò)濾（filtration）是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。過(guò)濾介質(zhì)（filter）：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等。81過(guò)濾分類(lèi)82根據(jù)顆粒大小的過(guò)濾分類(lèi)及其特性類(lèi)別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾2nm～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<2nm生物小分子、鹽、離子反滲透膜83一、非膜過(guò)濾(non-membranefiltration)采用高分子膜以外的材料，如濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過(guò)濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱(chēng)為非膜過(guò)濾，包括粗濾和部分微濾。1.粗慮2.微濾841．粗濾roughfiltration借助于過(guò)濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于2μm的大顆粒，使固形物與液體分離的技術(shù)稱(chēng)為粗濾。通常所說(shuō)的過(guò)濾就是指粗濾而言。助濾劑：加快過(guò)濾速度，提高分離效果硅藻土、活性炭、紙粕等。85（1）常壓過(guò)濾以液位差為推動(dòng)力的過(guò)濾方法濾紙過(guò)濾，吊籃或吊袋過(guò)濾設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易行方便，但過(guò)濾速度慢分離效果差86（2）加壓過(guò)濾以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為推動(dòng)力的過(guò)濾方法。設(shè)備簡(jiǎn)單，過(guò)濾較快，過(guò)濾效果好87（3）減壓過(guò)濾又稱(chēng)真空過(guò)濾(vacuumfiltration)或抽濾(suctionfiltration)，是通過(guò)在過(guò)濾介質(zhì)的下方抽真空，增加過(guò)濾介質(zhì)上下方之間的壓力差，推動(dòng)液體通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過(guò)濾方法。882．微濾microfiltration微濾又稱(chēng)為微孔過(guò)濾。微濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.2~2μm，主要用于細(xì)菌、灰塵等光學(xué)顯微鏡可以看到的物質(zhì)顆粒的分離。在無(wú)菌水、礦泉水、汽水等軟飲料的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。非膜微濾一般采用微孔陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過(guò)濾介質(zhì)，也可采用微濾膜為過(guò)濾介質(zhì)進(jìn)行膜分離。89微孔陶瓷Microporousceramic燒結(jié)金屬(青銅）SinteredBronzeFilter微濾膜micro-filtrationmembrane90二、膜分離技術(shù)(membraneseparationtechnology)借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱(chēng)為膜分離技術(shù)。薄膜主要由丙烯脂、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以來(lái)用動(dòng)物膜等。薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。91根據(jù)物質(zhì)顆粒或分子通過(guò)薄膜的原理和推動(dòng)力的不同，膜分離可以分為3大類(lèi)921．加壓膜分離加壓膜分離是以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)。在靜壓差的作用下，小于孔徑的物質(zhì)顆粒穿過(guò)膜孔，而大于孔徑的顆粒被截留。9394（1）微濾（Microfiltration，MF）以微濾膜（或非膜材料）作為過(guò)濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。截留顆粒在0.2~2μm,操作壓力在0.1Mpa以下。例如：無(wú)菌水除菌，酶液除微生物細(xì)胞細(xì)胞水鹽大分子小分子95一種靜態(tài)過(guò)濾，隨過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞微濾膜在各種分離膜中的產(chǎn)值最高，占世界膜技術(shù)總產(chǎn)值的50%以上（用于其它膜過(guò)程的前期處理過(guò)程）實(shí)驗(yàn)室常用：0.2μm或0.5μm的微濾膜＋真空泵＋抽濾瓶＋夾子＋溶液杯96（2）超濾（Ultrafiltration，UF）又稱(chēng)超過(guò)濾，是借助于超濾膜將不同大小的物質(zhì)顆?；蚍肿臃蛛x的方法。截留顆粒直徑在20~200nm，相當(dāng)于分子質(zhì)量為1×103～5×105

道爾頓。用于分離病毒和各種大分子。A、高分子溶質(zhì)之間（如蛋白質(zhì)分子之間的分級(jí)分離），以及高分子與小分子溶質(zhì)之間（如蛋白質(zhì)分子脫鹽）的分離B、Pro濃縮大分子水鹽小分子97超濾膜過(guò)濾原理98超濾膜致密膜、微孔膜、非對(duì)稱(chēng)膜非對(duì)稱(chēng)膜：使用最廣泛。一般由兩層組成：表面活性層和支撐層。表面活性層非常薄，厚度0.1－1.5μm。表面活性層起分離作用(即選擇透過(guò)作用)。支撐層起機(jī)械支撐作用，是多孔的，對(duì)分離特性和傳遞速率影響很小，厚度50－250μm。99膜的透過(guò)性一般以流率表示，即每平方厘米的膜每分鐘透過(guò)的流體的量。超濾時(shí)流率一般為0.01～5.0mL/cm2?min。影響流率的因素膜孔徑的大?。嚎讖酱螅髀蚀螅瑸橹饕蛩?。顆粒的形狀與大小：密度小、球狀、小分子的顆粒透過(guò)性較好。溶液濃度：濃度越高，超濾流率越小。操作壓力：一般壓力增加，超濾的流率亦增加，壓力一般控制在0.1～0.7MPa

。溫度、攪拌：適當(dāng)提高溫度，增加攪拌速度等利用提高流率。1003、反滲透（ReverseOsmosis，RO）在壓力作用下，溶劑（通常是水）透過(guò)膜，而溶質(zhì)被阻擋于膜壁外。截留顆粒直徑：小于2nm。操作壓力：0.7~13MPa。應(yīng)用：主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。在酶液的濃縮、無(wú)離子水的制備、海水淡化等方面廣泛應(yīng)用水鹽小分子大分子101102（4）納濾(Nanofiltration，NF)納濾膜主要用于截留粒徑在2～10nm，分子量為1000左右的物質(zhì)，可以使鹽和小分子物質(zhì)透過(guò)， 操作壓（0.5～1MPa）。其被分離物質(zhì)的尺寸介于反滲透膜和超濾膜之間。水鹽小分子大分子1032．電場(chǎng)膜分離電場(chǎng)膜分離是在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。在電場(chǎng)作用下，的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)，透過(guò)半透膜，而達(dá)到分離的目的。電滲析(electroosmosis)離子交換膜電滲析(ionexchangemembraneelectroosmosis)104（1）電滲析(electroosmosis)在電場(chǎng)作用下，帶電離子透過(guò)膜向兩極移動(dòng)，而達(dá)到分離的目的。+-極水鹽水

淡水電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備以及其他帶電荷小分子的分離。105（2）離子交換膜電滲析(ionexchangemembraneelectroosmosis)離子交換膜電滲析的裝置與一般電滲析相同。只是以離子交換膜代替一般的半透膜而組成。Anion106離子交換電滲析在酶液脫鹽、海水淡化、以及從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸等帶有電荷的小分子發(fā)酵產(chǎn)物等。1073．?dāng)U散膜分離利用小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作用，不斷透過(guò)半透膜擴(kuò)散到膜外。而大分子被截留，從而達(dá)到分離效果。常見(jiàn)的透析(dialysis)就是屬于擴(kuò)散膜分離。擴(kuò)撒Diffusion108透析膜可用動(dòng)物膜、羊皮紙、火棉膠或賽聰盼等制成。透析主要用于酶等生物大分子的分離純化，從中除去無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)。109透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

透析方法及裝置110第六節(jié)層析分離層析分離是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同比例分布在兩相中而達(dá)到分離。層析法也稱(chēng)色譜法（chromatography）層析中兩相為流動(dòng)相(mobilephase)和固定相(stationaryphase)，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分的移動(dòng)速度不同，從而使不同的組分分離純化。111極性相近的分之間，其親和力較強(qiáng)112層析方法分類(lèi)113層析分離方法層析方法分離原理吸附層析利用吸附劑對(duì)不同的物質(zhì)吸附能力不同而使混合物各組分分離分配層析利用不同的物質(zhì)在兩相的分配系數(shù)不同而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離集團(tuán)（活性集團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中各組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到分離的目的親和層析利用生物分子與配基專(zhuān)一而又可逆的親和力力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)的特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離114一、吸附層析吸附層析（adsorptionchromatography）是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。由于吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可以再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單，至今仍在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用。1151．吸附層析原理利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附力不同進(jìn)行分離。吸附：任何兩個(gè)相之間都可以形成一個(gè)界面，其中一個(gè)相中的物質(zhì)在兩相界面上的密集現(xiàn)象稱(chēng)為吸附。吸附劑：凡是能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)稱(chēng)為吸附劑。吸附劑一般是固體或者液體，在吸附層析中通常應(yīng)用的是固體吸附劑。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。116吸附層析示意圖吸附劑易吸附分子不易吸附分子被分離樣品與吸附劑之間主要作用力是范德華力。被吸附物能夠解吸117柱層析：將固定（吸附劑）相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。吸附劑種類(lèi)：活性氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鹽、活性碳、陶土、纖維素等。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程。118吸附層析操作步驟：裝柱→上樣→洗脫（1）先把吸附劑裝在玻璃柱中（吸附劑用量為分離樣品的30～50倍），使它形成層析柱；（2）將待分離的樣品從柱頂加入（加樣時(shí)避免沖動(dòng)基質(zhì)）；（3）當(dāng)樣品溶液全部流入吸附層析住后，加入洗脫劑。119不同的物質(zhì)吸附力和解吸力不同，移動(dòng)的距離不同。吸附力弱而解吸力強(qiáng)的物質(zhì)，移動(dòng)距離較大。吸附力強(qiáng)而解吸力弱的物質(zhì)，移動(dòng)距離較小。1201211221232．洗脫方法用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛘呷芤簭奈街邪驯晃浇M分洗脫出來(lái)的方法主要有3種。溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法124（1）溶劑洗脫法：溶劑洗脫法是采用單一或者混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。125洗脫曲線(xiàn)：用洗脫液體積對(duì)各組分濃度作圖，可以得到洗脫曲線(xiàn)流速太慢，前峰拖尾與后峰相連流速太快，組分分不開(kāi)，兩峰重疊正常的流速使組分完全分離126洗脫液的流速要恰當(dāng)控制太快，峰與峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的離子強(qiáng)度太慢，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，若峰間距離過(guò)大，可采用洗脫劑由弱到強(qiáng)的梯度洗脫方法(屬于離子交換層析)。127理想的洗脫曲線(xiàn)如圖所示。圖中的各峰均呈對(duì)稱(chēng)形，二者沒(méi)有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開(kāi)。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。128（2）置換洗脫法置換洗脫法又稱(chēng)為置換法或取代法，是用吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的洗脫物質(zhì)來(lái)洗脫樣品組分的方法。洗脫劑為置換洗脫液，含有置換劑（吸附力比被吸附組分更強(qiáng)）。階梯式的洗脫曲線(xiàn)。物質(zhì)濃度洗脫液體積AB各組分一個(gè)接一個(gè)，界限不分明，交界處互相混雜，分離效果并不理想。129（3）前緣洗脫法前緣洗脫法，又稱(chēng)為前緣分析法，是連續(xù)向吸附層析校內(nèi)加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合溶液本身。流出順序：純?nèi)軇┪搅ψ钊醯慕M分兩組分、三組分……多組分的混合混合液AA+BA+B+C只能將最前緣的組分A分開(kāi)1303．吸附劑與洗脫劑的選擇（1）吸附劑的選擇吸附劑是關(guān)鍵因素，尚無(wú)固法可循，操作中可根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)或者通過(guò)小樣試驗(yàn)來(lái)確定。吸附力的強(qiáng)弱：極性物質(zhì)容易被極性表面吸附非極性物質(zhì)容易被非極性表面吸附溶液中溶解度越大的物質(zhì)越難被吸附選擇原則：極性強(qiáng)的分離物，選擇極性小的吸附劑極性弱的分離物，選擇極性強(qiáng)的吸附劑131吸附劑具備條件表面積大、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉等吸附劑種類(lèi)可以分為無(wú)機(jī)吸附劑和有機(jī)吸附劑常用吸附劑包括硅膠、活性炭、磷酸鈣、碳酸鹽、氧化鋁、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖、瓊脂糖、菊糖、纖維素等。此外，還可以在吸附劑上連接親和基團(tuán)而制成親和吸附劑。132吸附劑預(yù)處理 去除雜質(zhì)、提高吸附力、增強(qiáng)分離效果。加熱處理：去除吸附在其中的水分、氣體氧化鋁，140℃高溫條件下加熱6h，使含水量降至0~3%活性炭，在使用前需于150℃加熱干燥4~5h，干燥除氣酸處理，以除去各種金屬離子。用于酶的分離純化的吸附劑硅藻土、氧化鋁、磷酸鈣、輕基磷灰石和活性炭等。在較低pH值、低離子強(qiáng)度的條件下對(duì)酶有較強(qiáng)的吸附作用，而在提高pH值和增加離子強(qiáng)度的條件下，酶可被解吸而洗脫下來(lái)。133（2）洗脫劑的選擇根據(jù)吸附劑的性質(zhì)和被吸附物的特點(diǎn)來(lái)選擇極性組分，用極性大的溶劑洗脫效果較好。非極性組分，用非極性溶劑洗脫較佳。洗脫劑的種類(lèi)：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等。按其極性的增大排列如下：石油醚、環(huán)已烷、四氯化碳、三氯己烷、甲苯、苯、二氯甲烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶乙酸等。134洗脫劑的選擇要注意下列各點(diǎn)：①洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，也不會(huì)使吸附劑溶解；②洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的溶解度大，黏度小，流動(dòng)性好，容易與被洗脫的組分分離；③洗脫劑要求一定的純度，以免雜質(zhì)對(duì)分離帶來(lái)不利影響。135二、分配層析分配層析（Partitionchromatography）是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)（distributioncoefficient）是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)，以K表示。固定相：吸附在多孔性固體支持物上的溶劑流動(dòng)相：與固定相溶劑互不相溶的溶劑，可沿著固定相流動(dòng)136分配層析分類(lèi)紙層析分配薄層層析分配氣相層析只適用于氣體組分的分離和分析檢測(cè)1371．紙層析（paperchromatography）固定相：濾紙纖維的結(jié)合水（6%~7%）流動(dòng)相：與水不相混溶或部分混溶的有機(jī)溶劑特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。所需樣品少展開(kāi)時(shí)間長(zhǎng)、分離量少，酶容易變性失活。1381392．薄層層析（thinlayerchromatography）固定相：支持物均勻地鋪在支持板（玻璃板）上，成為薄層流動(dòng)相：與水不相混溶或部分混溶的有機(jī)溶劑支持物為固體吸附劑如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等：主要依據(jù)吸附力的不同使組分分離，稱(chēng)為吸附薄層層析支持物為纖維、硅藻土，主要依據(jù)分配系數(shù)的不同而使組分分離的薄層層析法，稱(chēng)為分配薄層層析。特點(diǎn)：薄層層析的展開(kāi)時(shí)間短分辨率比紙上層析高10~100倍既可作分析用，分離0.01μg的微量樣品；又能作制備用，分離500mg甚至更多的樣品；薄層可以規(guī)格化制備。重現(xiàn)性比紙上層析差，對(duì)酶等生物大分子的分離效果不理想。140薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開(kāi)劑層析缸展開(kāi)劑濾紙條下行法薄層板141三、離子交換層析離子交換層析(ionexchangechromatography，IEC)是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。1、原理根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。1422、離子交換劑離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。離子交換劑由母體（載體）、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團(tuán)反離子143144按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同可以陽(yáng)離子交換劑：能吸附帶“+”的離子或酶（溶液pH＜pI）

酸性基團(tuán)：

-CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基）等陰離子交換劑：能吸附帶“-”的離子或酶（溶液pH＞pI）

堿性基團(tuán)：

-N+(CH3)3（季胺）、-N+(CH3)2（

叔胺）、-NHCH3（仲胺）根據(jù)母體不同可分為離子交換樹(shù)脂：交換容量不大，易使酶失活離子交換纖維素：最廣泛的一類(lèi)離子交換凝膠：不耐高流速洗脫145平衡常數(shù)在一定條件下，某種組分離子在離子交換劑上的濃度與在溶液中的濃度達(dá)到平衡時(shí)，兩者濃度的比值K稱(chēng)為平衡常數(shù)（也叫分配系數(shù)）。即：K的值越大，活性基團(tuán)對(duì)某組分離子的親和力就越大，表明該組分離子越容易被吸附。K值越大，保留時(shí)間就越長(zhǎng)。如果欲分離的溶液中各種組分離子的K值有較大的差別，通過(guò)離子交換層折就可以使這些組分離子得以分離。146離子交換劑的選擇①離子交換劑和組分離子的物理化學(xué)性質(zhì)：電荷高者＞電荷低者②組分離子所帶的電荷種類(lèi)：同性相吸③溶液中組分離子的濃度高低：濃度大者＞濃度小者④組分離子的質(zhì)量大小：質(zhì)量小的，采用小孔徑；質(zhì)量大的，采用大孔徑⑤組分離子與離子交換劑的親和力大小：親和力大的易吸附難洗脫，親和力小的難吸附，易洗脫147離子交換劑的處理（1）水浸泡：2h以上，使充分膨脹（2）無(wú)離子水洗滌（3）用酸浸泡，2mol/LHCl，4h，無(wú)離子洗滌至中性（4）用堿浸泡，2mol/LNaOH，4h，無(wú)離子水洗滌至中性（5）轉(zhuǎn)型處理，使離子交換劑上所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧碾x子。1483、離子交換層析的操作過(guò)程（1）裝柱干法裝柱：干燥的離子交換劑→柱子→加溶劑或溶液濕法裝柱：加溶劑或溶液→柱子→離子交換劑（2）上柱平衡：溶劑或緩沖液上樣：加入欲分離混合液，上樣體積1%~5%（交換劑總量）（3）洗脫和收集梯級(jí)洗脫（分時(shí)段改變洗脫液的pH或鹽離子強(qiáng)度）梯度洗脫（連續(xù)改變pH或鹽離子強(qiáng)度）（4）再生用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。149150四、凝膠層析凝膠層析（gelchromatography）指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠過(guò)濾（gelfiltration）分子篩層析（molecularsievechromatography）排阻層析（exclusionchromatography）1511、基本原理大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。152153分配系數(shù)Ka

(表示凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度):Ve——洗脫體積，表示某一組分從加進(jìn)層析柱到最高峰出現(xiàn)時(shí)，所需的洗脫液體積；Vo——外水體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆?？障吨g的體積；Vi——內(nèi)水體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。V0VolumeoutsideViVolumeintsideVi

=Vt

-Vo

VtVolumetotalVgVolumegel154凝膠過(guò)濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Ka=0時(shí),即Ve=Vo,說(shuō)明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.

0<Ka<1,Ve=KaVi+Vo,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Ka小的先流出，Ka大的后流出。Ⅲ.Ka=1時(shí),

Ve=Vo+Vi，說(shuō)明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。Ka＞1，表明凝膠對(duì)組分有吸附作用Vo洗脫液體積mLVeVo+Vi組分濃度ViIIIIII155分配系數(shù)Ka

的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果Ka差異大，分離效果好，Ka差異小，分離效果差。156流動(dòng)分離理論大分子不能進(jìn)入毛細(xì)管，最先流出中等大分子在毛細(xì)管中心區(qū)，流速較快，較快流出小分子在毛細(xì)管壁處，流速較慢，最后流出擴(kuò)散分離理論大分子擴(kuò)散到凝膠微孔中的程度小，較易被洗脫出小分子容易進(jìn)入到凝膠微孔中，較難被洗出。157Ve

與分子量(M)的關(guān)系:K1和K2對(duì)特定的層析柱來(lái)說(shuō)都是常數(shù).在同樣凝膠層析條件下，測(cè)定一系列已知分子量（M）蛋白質(zhì)的Ve，可作圖得一直線(xiàn).用此直線(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),求知未知蛋白的lgM.再由lgM求出M.lgMABCVelgMAlgMBlgMCVeCVeBVeA158利用相對(duì)洗脫體積Kav

對(duì)lgMr

做曲線(xiàn)，稱(chēng)為選擇曲線(xiàn)Kav

=Ve

/Vt

每一類(lèi)型的化合物都有其各自特定的選擇曲線(xiàn)。所以通過(guò)凝膠層析可以測(cè)定物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。3.54.05.55.05.56.000.51.0KavlgMr葡萄糖凝膠G200葡萄糖凝膠1200球蛋白的選擇曲線(xiàn)1592．凝膠的選擇與處理微孔凝膠是由凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成凝膠材料：葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等。交聯(lián)劑：環(huán)氧氯丙烷等。交聯(lián)劑加得越多，載體顆粒的孔徑就越小。其孔徑的大小決定其用于分離的組分顆粒的大小。160（1）葡聚糖凝膠（dextrangel)商品名:Sephadex，型號(hào)

SephadexG-10至G-200。G后的數(shù)字為凝膠吸水值的倍數(shù)。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。廣泛用于各種物質(zhì)的分離（2）瓊脂糖凝膠（agarosegel)

商品名:Sepharose

（瑞典）;Bio-GelA(美國(guó)）。瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。適用于分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和多糖的分離純化（3）聚丙烯酰胺（polyacrylamidegel）商品名為Bio-GelP,型號(hào)從Bio-GelP-2至P-300。P值越大，孔徑越大。惰性凝膠，適合酶,蛋白質(zhì)，核酸的分離純化，但不能遇強(qiáng)酸1613.操作步驟（1）凝膠的選擇和處理根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。（2）裝柱選擇粗細(xì)均勻的柱子。采用長(zhǎng)度：直徑（L/D）比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。凝膠分布均勻，不能有氣泡或裂紋存在。洗脫液浸過(guò)凝膠表面162（3）加樣（上柱）體積不能過(guò)多，不超過(guò)床體積的30％，通?？稍?0％左右。混合液的濃度可以高些，但是黏度宜低。（4）洗脫洗脫液與平衡時(shí)用的buffer一致。洗速不可過(guò)快，保持恒速。洗脫液體積一般為凝膠床體積的120%左右。（5）凝膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用0.02%疊氮鈉（NaN3）防腐。163五、親和層折親和層析(AffinityChromatography)是利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化的技術(shù)。又稱(chēng)為：功能層析（functionchromatography）生物專(zhuān)一吸附（biospecificadsorption）選擇層析（selectivechromatography）酶——底物（包括酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和輔因子）特異性抗原——抗體激素——受體

DNA——互補(bǔ)的DNA或RNA

凝集素——糖蛋白164將待純化物質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)分離提純。1651．親和層析母體和配基母體（Matrix）載體、擔(dān)體配體（ligand）配基臂（spacearm）瓊脂糖凝膠葡聚糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠纖維素小分子物質(zhì)（金屬離子等無(wú)機(jī)輔助因子、有機(jī)輔助因子等）作為配基時(shí)引入連接臂欲分離物質(zhì)雜質(zhì)166母體活化：目的：不溶性母體與配基以共價(jià)鍵偶聯(lián)不同的載體活化需要不同的活化劑。常用活化方法溴化氰法、疊氮法、高碘酸氧化法、環(huán)氧化法、甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法AgaroseOHOH+CNBrNaOHC=NHAgaroseOO+NH2—RC—NH—ROOHNH=AgaroseNaOH載體活化載體配體親和吸附劑1672．親和層析方法根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性，親和層析可以分為:分子對(duì)親和層析免疫親和層析共價(jià)親和層析疏水層析金屬離子親和層析染料親和層析凝集素親和層析168（1）分子對(duì)親和層析分子對(duì)親和層析（moleculepairaffinitychromatography）是利用生物分子對(duì)之間專(zhuān)一而又可逆的親和力使生物分子分離純化的一種親和層析方法。酶——底物酶——競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑酶——輔因子抗原——抗體酶RNA——互補(bǔ)RNARNA——互補(bǔ)DNA169配對(duì)的任何一方都可做固定相，另一方做流動(dòng)相控制條件溫度：0~10℃pH：吸附時(shí)在酶作用的最適pH，洗脫時(shí)在酶穩(wěn)定性好又不在最適pH170（2）免疫親和層析免疫親和層析（immuneaffinitychromatography）：是利用抗原與抗體之間專(zhuān)一而又可逆的親和力使抗體或者抗原分離純化的一種親和層析方法。又稱(chēng)為抗體親和層析配基抗原或抗體蛋白A或蛋白G可與IgG的Fc區(qū)域高度專(zhuān)一親和171172（3）共價(jià)親和層析共價(jià)親和層析（covalentaffinitychromatography）：是生物大分子中的功能性基團(tuán)與層析劑上配基形成可逆性的共價(jià)鍵的一種親和層析方法。例如，巰基化合物中的—SH基可與另一個(gè)—SH堪結(jié)合形成二琉鍵（—S—S—）?？捎肔-半胱氨酸、巰基乙醇、谷骯甘肽以及二硫蘇糖醇等小分子巰基化合物進(jìn)行洗脫。173（4）疏水層析

疏水層析（hydrophobicchromatography）：是酶蛋白中的疏水基團(tuán)與親和層析劑上的疏水基團(tuán)進(jìn)行可逆性疏水結(jié)合反應(yīng)的一種親和層析方法。酶蛋白通常含有疏水性較強(qiáng)的氨基酸，如亮氨酸、瀕氨酸和苯丙氨酸等，可以與親和層析劑上改性瓊脂糖的烷基發(fā)生疏水結(jié)合反應(yīng)，不同的蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)的數(shù)量和特性有所不同，可以通過(guò)疏水層析而得以分離。174低鹽濃度下，疏水基團(tuán)相互分離高鹽濃度下，疏水基團(tuán)相互親和175溶液中的高離子強(qiáng)度可以增強(qiáng)酶（蛋白質(zhì)）與疏水層析介質(zhì)的疏水相互作用；采用高離子溶液上樣，能夠使酶（蛋白質(zhì)）等分離組分吸附于疏水層析介質(zhì)；然后線(xiàn)性或階段地降低流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，將使吸附于介質(zhì)上的組分，按照疏水作用由弱到強(qiáng)，被依次洗脫下來(lái)。176（5）金屬離子親和層析金屬離子親和層析(metalionaffinitychromatography）：是利用蛋白分子中的一些氨基酸殘基與層析劑上的金屬離子進(jìn)行可逆性鰲合反應(yīng)的一種親和層析方法。氨基酸殘基：His咪唑基團(tuán)，Cys的巰基，Trp

吲哚基團(tuán)金屬離子：Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等用螯合劑將金屬離子螯合到母體（如交聯(lián)化的瓊脂糖、葡聚糖等）的表面上制成金屬親和層析劑。177MetalChelateAffinityChromatography178洗脫方法：改變鹽的濃度改變pH值置換：加入競(jìng)爭(zhēng)性試劑，如咪唑、組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等。優(yōu)點(diǎn)：母體可再生：強(qiáng)螯合劑可代替弱螯合劑螯合劑較穩(wěn)定：選擇適宜的金屬離子，可吸附不同蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)能保持活性179（6）染料親和層析染料親和層析（dye-ligandchromatography）是利用酶分子與一些染料上的基團(tuán)進(jìn)行可逆的親和反應(yīng)的一種親和層析方法。一些有機(jī)染料，如蒽醌化合物、偶氮化合物等，具有類(lèi)似于NAD+的結(jié)構(gòu)。一些需要核苷酸類(lèi)物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)這些染料有一定的親和力。常用的有機(jī)染料是二羥偶氮化合物。已成功地用于以NAD+、NADP+、ATP為輔酶的多種酶的分離純化。180羥基蒽醌NAD+蒽醌偶氮化合物181（7）凝集素親和層析凝集素親和層析（lectinaffinitychromatography）是利用酶蛋白與凝集素之間進(jìn)行可逆性親核反應(yīng)的一種親和層析方法。凝集素（1ectin）是一類(lèi)能與糖的殘基專(zhuān)一而又可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)。它們能與多糖、糖蛋白及紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凝集體等親和結(jié)合。182與固定化凝集素結(jié)合的物質(zhì)可用競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合試劑或離子濃度梯度洗脫下來(lái)183184凝集素親和層析可以用于各種糖蛋白的分離純化。例如，胞外超氧化歧化酶（EC-SOD）具有3種同工酶，都是含銅—鋅離子的糖蛋白。用肝素、瓊脂糖凝膠等為母體，以凝集素為配基制成親和層析劑進(jìn)行親和層析，可以將這3種同工酶分離純化。185六、層析聚焦層析聚焦（chromatofocusing）是將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。層析聚焦等電聚焦：聚焦作用，高分辨率離子交換層析：濃縮分離作用，大容量分離186基本原理利用層析過(guò)程中固定相偶聯(lián)的具有兩性解離功能的有機(jī)分子為配基，與流動(dòng)相中某些兩性物質(zhì)發(fā)生等電聚焦反應(yīng)而進(jìn)行分離流動(dòng)相多緩沖溶液，含兩性電解質(zhì)載體，在一定范圍pH值條件下具有相似的、較強(qiáng)的緩沖能力；Polybuffer96：pH6～9Polybuffer74：pH4~7

混合在一起，緩沖pH4~9187固定相為 多緩沖交換劑。是以Sepharose6B為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法把帶有多種電荷基團(tuán)的配體與其偶聯(lián)而制成的。PBE94：pH4~9PBE118：pH8~11188pH梯度的形成聚焦層析介質(zhì)上偶聯(lián)的多氨基多羧基的有機(jī)分子具有相應(yīng)的堿性和酸性離子交換基團(tuán)，當(dāng)用Polybuffer96時(shí)，先用高pH緩沖液平衡，再用低pH多緩沖液過(guò)柱，層析介質(zhì)能與緩沖液中的H+

或OH-作用而形成連續(xù)pH梯度，層析介質(zhì)都會(huì)帶上不同數(shù)目的負(fù)電荷當(dāng)溶液中帶負(fù)電荷的離子流過(guò)時(shí)就會(huì)根據(jù)各自pH不同在不同的部位發(fā)生交換聚焦，被吸附在介質(zhì)上然后用pH較低的緩沖液洗脫時(shí)，被吸附的物質(zhì)重新帶電荷，從介質(zhì)上解下來(lái)189-Cl--Cl--OH-+++淋洗液++-OH-pH低高pH=6從層析柱頂部到底部形成了pH6～9的梯度。190蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的pI和層析柱的pH值pH環(huán)境pH＜pIpH＞pIpH＜PIPro帶電性+-+吸附情況不吸附吸附解吸附某種pro加樣到已形成pH梯度的層析柱時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，pro迅速遷移至與它pI相同的部位，從此位置開(kāi)始，pro將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直至pH＜pI

、pro帶正電荷時(shí)，被洗脫下來(lái)191++++■層析聚焦的聚焦機(jī)制：8765+++++-0+Polybuffer聚焦在pI超越pI（帶負(fù)電）被吸附在低pH處帶正電被排斥192●

抹香鯨肌紅蛋白

(pI=8.2)追過(guò)

馬肌紅蛋白

(pI=7.4)193操作流程：聚焦層析柱起始緩沖液平衡樣液上樣多緩沖液淋洗洗脫液解吸附194第七節(jié)電泳分離帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱(chēng)為電泳（electrophoresis）。電泳技術(shù)（electrophoresistechnique）是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳按支持物體不同分為：1、紙電泳2、薄層電泳3、薄膜電泳4、凝膠電泳5、自由電泳6、等電聚焦電泳195在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。196遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)（pH，離子強(qiáng)度、電 滲）、支持體特性、緩沖液性質(zhì)（1）顆粒性質(zhì)：電荷越大、半徑越小、形狀越接近球形，遷移率越快。197（2）電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越高，遷移率越快。常壓電泳：電場(chǎng)強(qiáng)度一般為2~10V/cm，電壓為100~500V，電泳時(shí)間從幾十分鐘到幾十小時(shí)，多用于帶電荷的大分子物質(zhì)的分離高壓電泳：電場(chǎng)強(qiáng)度為20~200V/cm，電壓大于500V，電泳時(shí)間從幾分鐘到幾小時(shí)，多用于帶電荷的小分子物質(zhì)的分離。198（3）溶液性質(zhì)：pH值：離pI越遠(yuǎn)，遷移率越快。（用buffer）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，遷移率越低。（4）電滲：在電場(chǎng)中，溶液對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)濾紙纖維素帶有負(fù)電荷，使水分子帶有正電荷，向負(fù)極移動(dòng)，使帶正電粒子速度加快，帶負(fù)電荷粒子減慢?！绊?biāo)欤嫠睉?yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。199一、紙電泳紙電泳（paperelectrophoresis）是以濾紙為支持體的電泳技術(shù)。是最早使用的區(qū)帶電泳。

操作過(guò)程：1：支持物的選擇，一般采用層析濾紙為支持物。2：選擇一定的pH和一定強(qiáng)度的緩沖液3：點(diǎn)樣量要適當(dāng)，過(guò)多拖尾，過(guò)少難檢測(cè)4：電泳200201ElectrophoresisofhaemoglobinoncelluloseacetatepaperA:normalSS:sicklecellanaemia

鐮狀細(xì)胞貧血AS:sicklecelltrait鐮狀細(xì)胞特質(zhì)AC:haemoglobinCtrait血紅蛋白C特質(zhì)202二、薄層電泳薄層電泳(thin-layerelectrophoresis)是將支持體與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳的技術(shù)。支持體:淀粉最常用,廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、酶等的分離。纖維素硅膠瓊脂203三、薄膜電泳薄膜電泳（filmelectrophoresis）是以醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持體的電泳技術(shù)。薄膜電泳的分辨力雖然比不上凝膠電泳和薄層電泳，但是由于薄膜電泳具有簡(jiǎn)單、快速、區(qū)帶清晰、靈敏度高、易于定量和便于保存的特點(diǎn)，故廣泛用于各種酶的分離。204四、凝膠電泳凝膠電泳（gelelectrophoresis）是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。凝放電泳與其他電泳的主要區(qū)別在于凝膠電泳同時(shí)具有電泳和分子篩的雙重作用，具有很高的分辨力。支持體：聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。205聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。機(jī)械強(qiáng)度高，透明有彈性，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，沒(méi)有吸附作用和電滲作用，可以通過(guò)改變丙烯酰胺濃度和交聯(lián)劑濃度而制成不同孔徑的凝膠等顯著優(yōu)點(diǎn)。2061．聚丙烯酷胺凝胺的制備聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺（acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）

為單體，以N,N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene

bisacrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）

為交聯(lián)劑，在催化劑的作用下聚合而成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠。Acr:（CH2＝CH—CONH2）Bis:（CH2＝CH—CONH—CH2—HNCO—CH＝CH2）207208催化劑①可以用過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED）為化學(xué)聚合催化劑。在TEMED的催化下，過(guò)硫酸銨形成氧的自由基，氧的自由基引發(fā)單體與交聯(lián)劑的聚合作用。②用核黃素作為光聚合催化劑。光聚合可以用日光、電燈等作為光源。在痕量氧存在的條件下，核黃素經(jīng)光解作用形成