基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)

DNA聚合酶連鎖反應(yīng)DNA電泳分析DNA聚合酶連鎖反應(yīng)目的：聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)能短時(shí)間增殖、放大特定的DNA片段，而使得原先可能才只有幾個(gè)pg的DNA增加至mg，以利于其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。原理：變性反應(yīng)(denaturation),使DNA的兩股分離。緩冷配對(duì)反應(yīng)(annealing),使引子與目標(biāo)DNA配對(duì)。延長(zhǎng)反應(yīng)(extension),合成新的DNA股。每一個(gè)循環(huán)操作可使DNA的量添加一倍，若重復(fù)操作多次，以數(shù)學(xué)公式計(jì)算，DNA增加的量將會(huì)是2n,n是代表重復(fù)操作的次數(shù)。在理想的聚合酵素鏈鎖反應(yīng)條件下，DNA是以幾何級(jí)數(shù)增加。理論上，一個(gè)DNA分子若重復(fù)操作PCR25次，那么DNA的分子數(shù)將會(huì)擴(kuò)增到33554432個(gè)分子。這個(gè)DNA的量已足夠在Agarose凝膠電泳中觀察到。試劑、器材、儀器：10xPCRbuffer成分：500mMKCl、100mMTris-HCl、pH8.8、15mMMgCl2、1%TritonX-10010|J1探TaqDN聚合酶需要有Mg2+(MgCl2)才能進(jìn)行反應(yīng)；但是Mg2+會(huì)和帶負(fù)電的template、primer和dNTP結(jié)合，加強(qiáng)雙股DNA的鍵結(jié)。所以Mg2+的濃度會(huì)影響PCR的效率和特異性，Mg2+過(guò)低PCR產(chǎn)物會(huì)減少，此外Mg2+解凍時(shí)會(huì)有沉淀產(chǎn)生。dNTP成分：dATP、dCTP、dGTD、dTTP各1.25mM16p1探dNTP會(huì)和Mg2+結(jié)合，所以過(guò)量dNTP會(huì)影響Mg2+濃度?！^(guò)多的dNTP也會(huì)增加Taq的錯(cuò)誤率和抑制其活性。此外當(dāng)某一種dNTP的濃度較其它三種低時(shí)也會(huì)增加錯(cuò)誤率。Primers是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，存在于自然中生物的DNA復(fù)制(RNA引子)和聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)中人工合成的引子(通常為DNA引子)。TaqDNApolymerase從熱泉中的嗜熱性細(xì)菌仃hermusaquaticus)所分離出來(lái)的耐高溫DNA合成酵素，每秒大約合成150個(gè)核甘酸。dH2O滅菌水。PCR管為了使加熱均勻且快速，所以PCR專用管都是薄壁的。使用一般微量管取代，在時(shí)間控制上會(huì)有差異。常用的PCR管有0.2mL與0.5mL兩種體積；0.2mL管各家廠商都只有作薄壁的，但0.5mL管有分一般與PCR用，使用前需注意。不過(guò)現(xiàn)在用0.5管的PCR儀越來(lái)越少了；新機(jī)種都是用0.2管，甚至0.1半量管或384孔盤。PCR儀器將PCR步驟自動(dòng)化的儀器將試劑滴入PCR管混合均勻?qū)CR管制入PCR儀器設(shè)定反應(yīng)條件，反應(yīng)完畢即為所求DNA電泳分析目的：用電泳的方式來(lái)測(cè)量樣品DNA的純度及分子量大小，以利于其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。原理：DNA電泳主要是利用：1.正負(fù)電場(chǎng)DNA本身帶負(fù)電電泳膠內(nèi)部形成各種大小不同的孔洞DNA是高度負(fù)電荷的聚分子，且負(fù)電荷是均勻分布于骨架的磷酸根上，因此不論長(zhǎng)短，DNA的負(fù)電密度(即單位質(zhì)量帶有的負(fù)電荷數(shù)目)是相同的，因此在電場(chǎng)中感受的引力就相同(差異不大)。所以電泳DNA并不是依分子的電荷差異而分離，而是依分子大小、構(gòu)形差異而分離。一般而言，片段小的DNA因?yàn)榭梢源┻^(guò)較小的孔隙，所以泳動(dòng)速度較快，而大片段DNA只能通過(guò)大孔洞，所以速度較慢；分子的形狀也會(huì)影響電泳的速率，一般而言，速率大小為：超螺旋＞環(huán)型＞線型。此外，電泳DNA時(shí)，電壓的強(qiáng)度、膠體的濃度、及緩沖劑的種類都會(huì)影響移動(dòng)的快慢。試劑、器材、儀器：(1)電泳用染劑功能如問(wèn)題二所述(2)1%agarosegelagarosege的介質(zhì)孔隙較大‘polyacrylamide的孔隙較小。所以分離大分子DNA時(shí)，會(huì)依照有否連接載體、是否切割完全、樣品中DNA大致的分子量等調(diào)配適當(dāng)比例的agarose一般0.8%agaros適合區(qū)分0.5~10KbDNAo若DNAsize更大則須調(diào)降agaros的濃度比例(0.3%)若分離的DNA較小則需升高agaros的濃度(2%)。其實(shí)DNA的分離不盡然一定是agaros，e例如操作DNAsequencing時(shí)，為了更細(xì)微的比較，會(huì)使用olyacrylamide<gel(3)SybreGreen能嵌入DNA堿基中，經(jīng)UV光照射能放出可見(jiàn)光TAE電泳緩沖溶液做為緩沖溶液DNAMARKER做為分子量的對(duì)照組電泳槽數(shù)字影像系統(tǒng)(8)微波爐步驟:將TAE與agarose依適當(dāng)比例混合加熱。將1之混合液倒入agaros制備槽并去除氣泡、雜質(zhì)。將agaroseg加入電泳槽，并加入TAE覆蓋之。將DNA與loadingbuff混合，加入agaroseg孔洞。調(diào)整適當(dāng)電壓開始電泳。電泳完成后將agaroseg取出浸泡至SybreGree中30分鐘。以數(shù)字影像系統(tǒng)觀測(cè)，紀(jì)錄之。問(wèn)題一：DNA電泳后衛(wèi)何出現(xiàn)2條藍(lán)色，深藍(lán)色與淺藍(lán)分別由哪項(xiàng)化學(xué)物質(zhì)所呈色？

答:深藍(lán)：答:深藍(lán)：bromophenolBlue（溴酚藍(lán)）淺藍(lán)：XylenecyanolFF（二甲苯藍(lán)）問(wèn)題二:DNASample加入6