不同破壁方法提取黃酒麥曲中微生物總dna的比較研究

不同破壁方法提取黃酒麥曲中微生物總dna的比較研究

黃酒是中國(guó)的特產(chǎn)，享有“國(guó)酒”的美譽(yù)。黃酒的工藝、品種、口味歷經(jīng)千百年的歷史沉積和文化錘煉才逐步形成了今天獨(dú)具一格的魅力和神韻,是低糧耗、低酒精度、高營(yíng)養(yǎng)的釀造酒,是提倡發(fā)展的酒種,符合酒類市場(chǎng)低度、營(yíng)養(yǎng)、保健的消費(fèi)趨勢(shì)。以麥制曲、用曲釀酒是中國(guó)黃酒的特色,也是傳統(tǒng)操作技藝,享有“酒之骨”之稱。傳統(tǒng)麥曲在黃酒中既是糖化發(fā)酵的粗酶制劑,又作為少量釀酒原料和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保留在黃酒中。麥曲中蘊(yùn)含著一個(gè)非常復(fù)雜的混合微生物體系,在制曲過(guò)程中大量生長(zhǎng),產(chǎn)生各種酶類,為黃酒的發(fā)酵提供必需的酶類。傳統(tǒng)的方法研究麥曲中微生物具有很大的局限性:一是麥曲中的一些不可培養(yǎng)的微生物不能得到有效分離。二是只能靜態(tài)地研究麥曲中的微生物,不能動(dòng)態(tài)地研究制曲過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)變化過(guò)程。所以,傳統(tǒng)方法無(wú)法弄清制曲過(guò)程中麥曲微生物生長(zhǎng)變化情況。分子生物技術(shù)在混合微生物研究體系中的應(yīng)用,極大地方便了動(dòng)態(tài)研究微生物種群結(jié)構(gòu)變化的情況,能夠用來(lái)了解麥曲的微生物區(qū)系和種群數(shù)量,在認(rèn)識(shí)微生物群落的動(dòng)態(tài)變化上具有重要的作用。微生物分子生態(tài)學(xué)是通過(guò)分析樣品中DNA分子的種類、數(shù)量等基因組信息來(lái)反映樣品中微生物細(xì)胞的種類與種群比例等信息。它克服了培養(yǎng)方法的局限性,直接對(duì)環(huán)境樣品中的微生物基因組DNA的組成狀況進(jìn)行分析評(píng)價(jià),所以,樣品總DNA的提取是研究的前提條件和關(guān)鍵,可靠、高效的混合樣總DNA提取方法非常重要。通常,評(píng)價(jià)一種DNA提取方法的好壞主要從5個(gè)方面考慮:(1)所得DNA具備理想的純度;(2)DNA要足夠完整,破損程度小;(3)DNA的量要充足;(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶數(shù)盡可能多;(5)方法盡可能簡(jiǎn)便、省時(shí)、費(fèi)用低。麥曲樣品中成分復(fù)雜,提取麥曲樣品總DNA用于分析其中微生物的多樣性時(shí),不僅要最大限度地提取到每個(gè)物種的DNA,而且要保證片斷足夠大,雜質(zhì)少。如果用溫和的提取方法進(jìn)行提取,固然可以得到大片段的DNA,但又不能保證使樣品中絕大多數(shù)的微生物破壁,會(huì)降低結(jié)果中的微生物多樣性,而用劇烈的提取方法,能將絕大多數(shù)的微生物破壁,但往往使大量DNA被剪切,從而使得到的DNA沒(méi)有分析價(jià)值。本文采用物理法(超聲波)、酶法(Yatalase酶)、化學(xué)法(氯化芐)對(duì)黃酒麥曲樣品進(jìn)行破壁,提取微生物總DNA,并通過(guò)細(xì)胞裂解率、DNA的純度、片段的分布情況、ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性來(lái)評(píng)估不同的破壁方法對(duì)麥曲樣品總DNA提取效果的影響,確定一種合適的破壁方法來(lái)提取麥曲總DNA。1材料和方法1.1材料和樣品的預(yù)處理1.1.1材料表面黃酒麥曲樣品由黃酒公司提供。取樣后立即保存于4℃,并于48h內(nèi)抽提DNA;純種微生物(米曲霉和酵母)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。1.1.2懸浮液懸浮液制備無(wú)菌條件下,將粉碎好的麥曲加入帶玻璃珠的三角瓶中,加入無(wú)菌生理鹽水洗滌麥曲,將懸浮液濾紙過(guò)濾后,濾液經(jīng)離心收集沉淀,4℃保存?zhèn)溆?。取適量無(wú)菌生理鹽水洗滌純種微生物的斜面,收集菌液,4℃保存?zhèn)溆谩?.2不同的分解方法，不同的麥曲樣品1.2.1超聲波處理根據(jù)Picard等方法改進(jìn)。取樣品200mg,加入3mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振蕩混勻,加入0.9mL10%SDS后,超聲波(600W)在4℃冰浴下處理10min。離心,上清液0℃保存?zhèn)溆谩?.2.2so4-3-1h42so4的制備取樣品200mg,加入3mL蘋果酸緩沖液(pH5.5)振蕩混勻,加入2%Yatalase(TaKaRa,上海)和終濃度為0.6mol/L的(NH4)2SO4,30℃保溫4h,每10min上下顛倒混勻。加入0.2倍體積的石英砂,劇烈振蕩2min,離心,上清液0℃保存?zhèn)溆谩?.2.3酶處理過(guò)濾法根據(jù)朱衡等方法改進(jìn)。取樣品200mg,加入2mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振蕩混勻,加入0.6mL10%SDS、3mL氯化芐和0.2倍體積的石英砂,劇烈振蕩混勻。50℃保溫1h,每隔10min振蕩混勻1次。加入1.5mL3mol/L醋酸鈉(pH5.2),冰上放置15min,離心,上清液0℃保存?zhèn)溆谩?.3-羥基苯磺酸t(yī)e的制備取保存的上清液,加入0.1倍體積3mol/L的醋酸鈉和0.6倍體積的異丙醇,冰上沉淀5min,10000r/min離心,沉淀用200μLTE溶解,加入適量RNAase,65℃水浴15min,加入200μL苯酚-氯仿(苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1)抽提至界面無(wú)可見(jiàn)物,取200μL上清液加入氯仿:異戊醇(24:1)再抽提1次,上清液加入0.1倍體積3mol/L的醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇,10000r/min離心10min,沉淀用70%乙醇洗滌1次,室溫放置,待乙醇完全揮發(fā)后,40μLTE溶解沉淀后,-20℃保存。1.4關(guān)于唾液和培養(yǎng)基的分解率計(jì)算采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)裂解反應(yīng)前后的孢子和酵母總數(shù)計(jì)數(shù),計(jì)算裂解率。1.5總dna提取純度和濃度測(cè)定應(yīng)用GeneQuantPro(Biochrom,England),將提取的麥曲總DNA樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后,分別測(cè)定DNA樣品在260nm和280nm處的吸光值,并計(jì)算OD260/OD280的比值來(lái)確定樣品的純度、濃度和提取率。計(jì)算方法如下:式中*:OD值相當(dāng)于50μg/mL的雙螺旋DNA。1.6pcr擴(kuò)增真菌真菌的ITS擴(kuò)增參照White等的方法。引物pITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,pITS4:5’-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3’(上海生物工程公司合成)被用來(lái)擴(kuò)增真菌的ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))保守序列。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:50μL的總反應(yīng)體積中含有1μLdNTP(10mmol/L),5μL10×Buffer,10mmol的MgCl2,2.5U的TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司),引物pITS1、pITS4各10pmol,DNA模板量80ng。擴(kuò)增條件:95℃變性5min,75℃加入TaqDNA聚合酶。94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,31個(gè)循環(huán)后,最后72℃延伸10min。ITS-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后,凝膠成像系統(tǒng)拍照,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2結(jié)果與分析2.1分離和提取dna一般提取環(huán)境樣品中的DNA有2種方法:一是直接從環(huán)境樣品中提取DNA。二是用等滲液、離心等方法使環(huán)境樣品中微生物與各種雜質(zhì)分離,然后提取微生物的DNA。麥曲中的霉菌和酵母菌附著在小麥麥粒上,若直接用麥曲來(lái)提取混合微生物的總DNA,物理法的破壁效率將十分低,酶法破壁用酶量也將很大。故實(shí)驗(yàn)采用無(wú)菌水沖洗麥曲至鏡檢基本無(wú)孢子和酵母后,過(guò)濾,離心濃縮,可得到麥曲中的霉菌孢子和酵母。2.2微生物的dna要對(duì)麥曲進(jìn)行微生物多樣性研究,微生物的完全裂解是確保提取麥曲中所有微生物DNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和多樣性的前提。到目前為止,提取環(huán)境中總DNA的研究基本上集中在土壤、河流的沉淀物等的原核生物上。而對(duì)于真核生物的研究比較少,對(duì)于真菌孢子和酵母的裂解通常采用的方法有物理法(如超聲破碎法、珠磨勻漿法)、酶法(如Yatalase酶、蝸牛酶破壁法)、化學(xué)法(如氯化芐法)。實(shí)驗(yàn)以米曲霉的孢子和釀酒酵母作參照,對(duì)麥曲微生物的浸提液采用了3種裂解方式,裂解率如表1所示。從表1中可以看出,采用超聲波法裂解細(xì)胞的效率最低,化學(xué)裂解法的效率最高。2.3dna提取率計(jì)算采用3種方法提取的麥曲樣品中微生物的基因組DNA,經(jīng)純化后測(cè)定DNA的OD260/OD280值,計(jì)算所得DNA濃度及提取率,結(jié)果見(jiàn)表2。一般DNA的OD260/OD280值接近1.8最好。從表2可以看出,氯化芐法的破壁效果最好,獲得的DNA總量最多,但含有很多的雜質(zhì),純度相對(duì)較低。其次是酶法,獲得的DNA總量雖然不多,但是純度最高。通過(guò)超聲波法得到的DNA產(chǎn)量較低,而且雜質(zhì)含量較高。2.4dna產(chǎn)物的序列采用不同方法提取DNA的片段的大小在瓊脂糖凝膠上的分布如圖1所示。從圖1中可以看出,采用酶法和氯化芐法提取的DNA,產(chǎn)物片斷分布均勻,從100bp~20kb均有。Picard等用超聲波的方法處理鏈霉菌孢子3遍,裂解率達(dá)100%,而實(shí)驗(yàn)中超聲波破碎方法的破壁率很低,只有25.9%左右,原因是超聲波對(duì)真核生物的孢子和原核生物的孢子作用效果不同,得到的DNA片段長(zhǎng)度也很小,集中分布在500bp~2000bp,不適合作為PCR擴(kuò)增的模板。2.5多態(tài)性分析促進(jìn)了iprc的產(chǎn)物3種方法提取的麥曲中微生物總dna的pcr擴(kuò)增效果目前,還未能弄清楚麥曲中的微生物具體組成和制曲、發(fā)酵過(guò)程中微生物組成結(jié)構(gòu)的變化情況等,傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方式不能有效解決這些問(wèn)題,分子生物技術(shù)在微生物生態(tài)上的應(yīng)用,使得上述問(wèn)題的解決成為可能。實(shí)驗(yàn)先是結(jié)合國(guó)外非常流行的珠磨均漿法,改進(jìn)了氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA,比較了超聲波法、酶法、氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA的效果,通過(guò)對(duì)破壁效率、純度、得率和PCR擴(kuò)增效果的綜合分析,采用氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA的破壁效率為(85.7±2.1)%、純度為1.512、得率為75μg/g曲、PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)為6條,因此選用氯化芐法提取麥曲樣品中微生物總DNA。3種不同提取方法