超聲波與腌制聯(lián)合提取核酸的研究

超聲波與腌制聯(lián)合提取核酸的研究

核糖核酸（ribenson，rn）是生物中的一種重要化合物。RNA對(duì)維持機(jī)體的正常功能有重要作用，是特定生理?xiàng)l件下不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。外源性核酸在機(jī)體營(yíng)養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和疾病防治等方面都有一定的功能。另外,核酸在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中有著重要用途,它涉及食品、醫(yī)療、農(nóng)牧業(yè)和生化試劑等領(lǐng)域。某些核酸類物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)保健食品的添加劑,對(duì)促進(jìn)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育、老年人的減緩衰老和身體虛弱的病后康復(fù)均有一定效果；在農(nóng)牧漁業(yè)中，核酸類物質(zhì)作為植物生長(zhǎng)刺激劑和飼料添加劑獲得了明顯的經(jīng)濟(jì)效益；在醫(yī)藥界，一些核酸類藥物正在許多領(lǐng)域發(fā)生重大影響，成為治療冠心病和病毒性疾病的主要藥物；在科研中，核酸類藥物作為生化制劑已達(dá)數(shù)百種。目前，我國(guó)核酸生物技術(shù)工程項(xiàng)目亟待加速開發(fā)，以扭轉(zhuǎn)我國(guó)核酸原料依賴進(jìn)口的狀況。專家們指出，要加速我國(guó)核酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，應(yīng)加快開發(fā)核酸原料，搞好綜合利用。我國(guó)是啤酒生產(chǎn)大國(guó)，啤酒生產(chǎn)中會(huì)帶來大量的廢酵母，啤酒酵母含有豐富的RNA,主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),含量達(dá)2%～8%，在本文中主要討論從啤酒廢酵母中提取核糖核酸的方法，對(duì)酵母進(jìn)行綜合利用。1材料和方法1.1材料表面啤酒廢酵母：由河北新世紀(jì)釀造有限公司提供；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、鉬酸銨、高氯酸等為分析純。1.2主要設(shè)備LG10-2.4A離心機(jī)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，UV-2102型分光光度計(jì)，pH計(jì)，SCT-3A快速水分測(cè)定儀。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1原材料預(yù)處理1.3.2工藝1.3.3測(cè)定含酸量1.3.3.石英比色法取一定量處理好的酵母泥，用5%高氯酸在100℃下水解15min,3600r/min離心15min，取上清液，用石英比色皿，在260nm,280nm光柱1cm，測(cè)OD值。其中0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.核酸量的測(cè)定核酸類含有雙鍵的物質(zhì)在260nm處具有最大紫外吸收。把離心后的上清液稀釋到合適的濃度，測(cè)定其在260nm處的紫外吸收值，計(jì)算上清液中的核酸量。核酸含量（mg）=×上清液體積×稀釋倍數(shù)×10-3其中0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.離心分離測(cè)量取兩個(gè)試管，按照表1加入，混勻，冰水浴中放置30min，離心分離，上清液測(cè)量A260nm。2號(hào)試管的OD260為總的核酸、核苷酸堿基的吸收值,1號(hào)試管的OD260為核苷酸等小分子的吸收值，兩者之差即為核酸大分子的值。1.3.4取酸純度的提取純RNA溶液的A260/A280比值為2.0，樣品中若含有蛋白質(zhì),則A260/A280比值將下降。1.3.5超聲時(shí)間對(duì)沉積物提取的影響在不同的超聲時(shí)間下對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行核酸提取，測(cè)定提取上清液中的核酸含量和純度，并計(jì)算核酸的提取率。1.3.6超聲波功率對(duì)原子能提取的影響在不同的超聲波功率下對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行核酸提取，測(cè)定提取上清液中的核酸含量和純度，并計(jì)算核酸的提取率。1.3.7母濃度對(duì)提取氨基酸的影響考察不同酵母濃度時(shí)，超聲波提取核酸的效果。1.3.8超聲和鹽處理法的結(jié)合提取核酸的效果在不同食鹽濃度下對(duì)酵母中的核酸進(jìn)行超聲波提取，測(cè)定提取上清液中的核酸含量和純度，并計(jì)算核酸的提取率。2結(jié)果與分析2.1超聲時(shí)間對(duì)沉積物提取的影響對(duì)溶液超聲以不同時(shí)間來檢測(cè)上清液中的核酸，結(jié)果見圖1。2.2提取出的核酸純度降低在酵母濃度分別為5%和10%時(shí)，對(duì)溶液超聲提取核酸，結(jié)果見圖1。由圖1可看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，核酸的提取量和核酸的提取率均增加，但是提取出的核酸的純度略有下降。原因可能是，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母細(xì)胞的破壁率增大，同時(shí)有利于核酸和蛋白質(zhì)的滲出。由圖1還可知道，低酵母濃度有利于核酸的提取，但是在酵母濃度增大的同時(shí)延長(zhǎng)超聲破壁時(shí)間有助于提取高濃度酵母中的核酸并增加核酸最終提取的純度，但低濃度的酵母溶液卻隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)提取核酸的純度呈下降趨勢(shì)，分析原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壁使得低濃度酵母溶液中的蛋白開始大量釋放。2.3超聲波功率對(duì)提取出的核酸的影響對(duì)酵母溶液采用不同的超聲波功率提取核酸，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著超聲波功率的增大，提取出的核酸在增加，同時(shí)核酸的純度卻逐漸下降。分析原因可能是由于高強(qiáng)度的超聲波對(duì)酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁損傷較嚴(yán)重，對(duì)核酸和蛋白的溶出均起促進(jìn)作用。2.4兩種提取核酸效果的比較對(duì)超聲波單獨(dú)作用和它與不同濃度食鹽協(xié)同作用酵母提取核酸的效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在超聲波提取酵母核酸時(shí)，加入低濃度的食鹽有助于提取核酸，但是食鹽濃度過高，核酸的提取效果會(huì)降低。2.5試驗(yàn)結(jié)果分析對(duì)超聲波和食鹽聯(lián)合破壁的條件進(jìn)行試驗(yàn)，按照以上因素水平采用L16(45)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見圖4。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析其存在顯著性，結(jié)果見表3。由正交實(shí)驗(yàn)及方差分析可以看出，酵母濃度、破壁時(shí)間、破壁功率對(duì)核酸的提取率影響很大，氯化鈉濃度對(duì)核酸的提取率影響不算顯著；酵母濃度對(duì)總核酸量的影響顯著。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲波與食鹽結(jié)合提取核酸的最佳條件為：酵母濃度3%，破壁時(shí)間為35min，破壁功率為90W，食鹽加量為1.3%。3超聲波提取核酸3.1對(duì)超聲波提取酵母核酸