超聲波與腌制聯(lián)合提取核酸的研究

超聲波與腌制聯(lián)合提取核酸的研究

核糖核酸（ribenson，rn）是生物中的一種重要化合物。RNA對維持機(jī)體的正常功能有重要作用，是特定生理條件下不可缺少的營養(yǎng)成分。外源性核酸在機(jī)體營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和疾病防治等方面都有一定的功能。另外,核酸在國民經(jīng)濟(jì)中有著重要用途,它涉及食品、醫(yī)療、農(nóng)牧業(yè)和生化試劑等領(lǐng)域。某些核酸類物質(zhì)作為營養(yǎng)保健食品的添加劑,對促進(jìn)兒童的生長發(fā)育、老年人的減緩衰老和身體虛弱的病后康復(fù)均有一定效果；在農(nóng)牧漁業(yè)中，核酸類物質(zhì)作為植物生長刺激劑和飼料添加劑獲得了明顯的經(jīng)濟(jì)效益；在醫(yī)藥界，一些核酸類藥物正在許多領(lǐng)域發(fā)生重大影響，成為治療冠心病和病毒性疾病的主要藥物；在科研中，核酸類藥物作為生化制劑已達(dá)數(shù)百種。目前，我國核酸生物技術(shù)工程項目亟待加速開發(fā)，以扭轉(zhuǎn)我國核酸原料依賴進(jìn)口的狀況。專家們指出，要加速我國核酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，應(yīng)加快開發(fā)核酸原料，搞好綜合利用。我國是啤酒生產(chǎn)大國，啤酒生產(chǎn)中會帶來大量的廢酵母，啤酒酵母含有豐富的RNA,主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),含量達(dá)2%～8%，在本文中主要討論從啤酒廢酵母中提取核糖核酸的方法，對酵母進(jìn)行綜合利用。1材料和方法1.1材料表面啤酒廢酵母：由河北新世紀(jì)釀造有限公司提供；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、鉬酸銨、高氯酸等為分析純。1.2主要設(shè)備LG10-2.4A離心機(jī)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，UV-2102型分光光度計，pH計，SCT-3A快速水分測定儀。1.3實驗方法1.3.1原材料預(yù)處理1.3.2工藝1.3.3測定含酸量1.3.3.石英比色法取一定量處理好的酵母泥，用5%高氯酸在100℃下水解15min,3600r/min離心15min，取上清液，用石英比色皿，在260nm,280nm光柱1cm，測OD值。其中0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.核酸量的測定核酸類含有雙鍵的物質(zhì)在260nm處具有最大紫外吸收。把離心后的上清液稀釋到合適的濃度，測定其在260nm處的紫外吸收值，計算上清液中的核酸量。核酸含量（mg）=×上清液體積×稀釋倍數(shù)×10-3其中0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.離心分離測量取兩個試管，按照表1加入，混勻，冰水浴中放置30min，離心分離，上清液測量A260nm。2號試管的OD260為總的核酸、核苷酸堿基的吸收值,1號試管的OD260為核苷酸等小分子的吸收值，兩者之差即為核酸大分子的值。1.3.4取酸純度的提取純RNA溶液的A260/A280比值為2.0，樣品中若含有蛋白質(zhì),則A260/A280比值將下降。1.3.5超聲時間對沉積物提取的影響在不同的超聲時間下對啤酒廢酵母進(jìn)行核酸提取，測定提取上清液中的核酸含量和純度，并計算核酸的提取率。1.3.6超聲波功率對原子能提取的影響在不同的超聲波功率下對啤酒廢酵母進(jìn)行核酸提取，測定提取上清液中的核酸含量和純度，并計算核酸的提取率。1.3.7母濃度對提取氨基酸的影響考察不同酵母濃度時，超聲波提取核酸的效果。1.3.8超聲和鹽處理法的結(jié)合提取核酸的效果在不同食鹽濃度下對酵母中的核酸進(jìn)行超聲波提取，測定提取上清液中的核酸含量和純度，并計算核酸的提取率。2結(jié)果與分析2.1超聲時間對沉積物提取的影響對溶液超聲以不同時間來檢測上清液中的核酸，結(jié)果見圖1。2.2提取出的核酸純度降低在酵母濃度分別為5%和10%時，對溶液超聲提取核酸，結(jié)果見圖1。由圖1可看出，隨著超聲時間的延長，核酸的提取量和核酸的提取率均增加，但是提取出的核酸的純度略有下降。原因可能是，隨著超聲時間的延長，酵母細(xì)胞的破壁率增大，同時有利于核酸和蛋白質(zhì)的滲出。由圖1還可知道，低酵母濃度有利于核酸的提取，但是在酵母濃度增大的同時延長超聲破壁時間有助于提取高濃度酵母中的核酸并增加核酸最終提取的純度，但低濃度的酵母溶液卻隨著超聲時間的延長提取核酸的純度呈下降趨勢，分析原因可能是長時間的超聲破壁使得低濃度酵母溶液中的蛋白開始大量釋放。2.3超聲波功率對提取出的核酸的影響對酵母溶液采用不同的超聲波功率提取核酸，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著超聲波功率的增大，提取出的核酸在增加，同時核酸的純度卻逐漸下降。分析原因可能是由于高強(qiáng)度的超聲波對酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁損傷較嚴(yán)重，對核酸和蛋白的溶出均起促進(jìn)作用。2.4兩種提取核酸效果的比較對超聲波單獨作用和它與不同濃度食鹽協(xié)同作用酵母提取核酸的效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在超聲波提取酵母核酸時，加入低濃度的食鹽有助于提取核酸，但是食鹽濃度過高，核酸的提取效果會降低。2.5試驗結(jié)果分析對超聲波和食鹽聯(lián)合破壁的條件進(jìn)行試驗，按照以上因素水平采用L16(45)正交設(shè)計進(jìn)行實驗，因素水平設(shè)計見表2，正交試驗結(jié)果見圖4。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析其存在顯著性，結(jié)果見表3。由正交實驗及方差分析可以看出，酵母濃度、破壁時間、破壁功率對核酸的提取率影響很大，氯化鈉濃度對核酸的提取率影響不算顯著；酵母濃度對總核酸量的影響顯著。綜合實驗結(jié)果可知，超聲波與食鹽結(jié)合提取核酸的最佳條件為：酵母濃度3%，破壁時間為35min，破壁功率為90W，食鹽加量為1.3%。3超聲波提取核酸3.1對超聲波提取酵母核酸