不同直鏈淀粉含量的rva譜分析

不同直鏈淀粉含量的rva譜分析

0反義蠟質(zhì)基因的轉(zhuǎn)化育種技術(shù)在稻米質(zhì)量品質(zhì)改良中的應用[研究意義]大米是人們食用的主要部分，完善淀粉質(zhì)量是水稻產(chǎn)品品質(zhì)育種的重要組成部分。稻米的淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉之分,直鏈淀粉在淀粉總量中所占的比例,直接關(guān)系到稻米的蒸煮品質(zhì)和食用品質(zhì)。通常,直鏈淀粉含量高的品種,米飯的出飯率高,而黏度和口感差,但直鏈淀粉含量低于2.0%,則成為了糯稻,食用范圍就受限制?！厩叭搜芯窟M展】水稻直鏈淀粉的合成是受結(jié)合在淀粉粒上的淀粉合成酶(GBSS)控制。分子生物學研究不僅揭示了該酶由蠟質(zhì)基因(waxygene)編碼,而且也搞清楚了蠟質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)和功能。同時,利用基因工程技術(shù)合成了不同的反義蠟質(zhì)基因片段,并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入到不同的水稻中,成功地培育了直鏈淀粉含量明顯降低的轉(zhuǎn)基因純合株系,實踐證明反義蠟質(zhì)基因的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)已成為稻米淀粉品質(zhì)改良有效方法。近年來,隨著淀粉黏度速測儀(rapidviscosityanalyzer)和相關(guān)配套分析軟件的誕生,利用該儀器能大量、快速、穩(wěn)定檢測稻米淀粉黏滯特性的優(yōu)點,開始進行不同亞種、品種間稻米淀粉黏滯性譜特征值的比較,RVA譜穩(wěn)定性分析,RVA譜特征值的基因型與環(huán)境互作效應分析,RVA譜特征與稻米主要品質(zhì)指標的相關(guān)性分析,淀粉合成相關(guān)基因?qū)VA譜特征的影響等方面的研究,并進行了水稻亞(品)種間淀粉黏滯性雜交轉(zhuǎn)移的初步研究,以及利用RVA譜特征值作為輔助選擇指標進行早稻食用品質(zhì)改良研究。這些研究和探索對稻米RVA譜特征的進一步認識和利用有著積極的意義,但是,這些研究大多是基于不同品種間的比較,存在著遺傳背景差異和不同基因互作的影響?！颈狙芯壳腥朦c】本研究以反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)基因純合株系為材料,通過直鏈淀粉含量的測定,選擇直鏈淀粉含量不同的株系,進行RVA譜特征值測定與分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】品種間的比較存在遺傳背景差異的影響,而通過同品種反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)基因純合株系間的比較,能直接比較不同直鏈淀粉含量對RVA譜特征值的影響。1材料和方法1.1試驗材料轉(zhuǎn)化受體為粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)武運粳7號(9522)。1.2潮霉素抗性基因融合質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacients)菌株為EHA105,融合質(zhì)粒pCAMBIA1300和p13W8,pCAMBIA1300的T-DNA區(qū)中攜帶著潮霉素抗性基因(hpt),p13W8的T-DNA區(qū)中只含反義蠟質(zhì)基因片段,而無hpt,該二個融合質(zhì)粒均由中國科學院上海植物生理研究所王宗陽教授提供。1.3根癌基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化方法參見沈革志等的方法。1.4pcr和冷思考中潮霉素抗性基因檢測葉片潮霉素抗性檢測參見沈革志等方法。用檢測抗潮霉素抗性基因和反義蠟質(zhì)基因的引物分別對轉(zhuǎn)基因植株及其花培后代進行PCR擴增:PCR擴增產(chǎn)物為450bp片段者為無潮霉素抗性基因的陽性株;PCR產(chǎn)物同時有450和598bp兩條帶者為含抗潮霉素抗性基因的陽性株;PCR產(chǎn)物只有598bp片段者為含潮霉素基因轉(zhuǎn)基因陰性株;PCR產(chǎn)物無片段者為非轉(zhuǎn)基因植株。植株總DNA提取和擴增條件參見Edwards等方法,反義蠟質(zhì)基因擴增的專一性產(chǎn)物片段約450bp,潮霉素抗性基因擴增的專一性產(chǎn)物片段約598bp。1.5旋轉(zhuǎn)植物的直鏈淀粉含量測定采用1989農(nóng)業(yè)部部頒標準“NY147-88”方法簡化后,對轉(zhuǎn)基因花培后代的株系種子進行直鏈淀粉含量測定。1.6粘滯速率的測定采用用澳大利亞NewportScientific儀器公司的3-D型粘滯速測儀RVA測定,并用TCW(thermalcycleforwindows)配套軟件分析。1.7統(tǒng)計分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(DPSTMv9.50標準版)進行數(shù)據(jù)顯著性測定、優(yōu)化模型的建立和分析。2結(jié)果與分析2.1葉片潮霉素抗性鑒定和花藥培養(yǎng)經(jīng)共轉(zhuǎn)化共獲得58個轉(zhuǎn)基因植株,用鑒定反義蠟質(zhì)基因的引物,對各植株進行PCR檢測,有27株為陽性,占總數(shù)的46.6%。種植各陽性株的T1群體,并對各株進行葉片潮霉素抗性鑒定,獲得了252個對潮霉素抗性表現(xiàn)敏感的單株;在其中的8個轉(zhuǎn)基因T1群體中,選擇了40個反義蠟質(zhì)基因PCR檢測為陽性,取葉片潮霉素抗性表現(xiàn)敏感的單株進行花藥培養(yǎng),獲得了424棵花培試管苗。經(jīng)抽穗期形態(tài)鑒定,161份為正常的二倍體。用鑒定反義蠟質(zhì)基因的引物對各植株進行PCR檢測,從中篩選到105個陽性株。2.2不同獨立轉(zhuǎn)化株的選擇分別對來自8個獨立轉(zhuǎn)化株的海南南繁T1H1單株和上海種植T1H2的77個株系,進行了直鏈淀粉含量(amylosecontent,AC)測定,結(jié)果顯示:接近對照的有19個株系,AC>15.0%;比對照低1.1%～1.9%的株系有10個(14.0%>AC>15.0%);比對照低2.1%～4.0%的株系有38個(12.0%>AC>13.9%);直鏈淀粉含量為11.0%～11.9%的有2個株系;有8個株系籽粒呈蠟質(zhì)狀,直鏈淀粉含量為3.1%～4.0%。表1是5個來自不同獨立轉(zhuǎn)化株的38個T1H2花培株系的直鏈淀粉含量,其中,35-17獨立轉(zhuǎn)化株5個花培株系間的直鏈淀粉含量差異很小,沒有出現(xiàn)分離,且與對照相近;35-15獨立轉(zhuǎn)化株6個花培株系間的直鏈淀粉含量分別低于對照1.9%～2.5%,株系間的最大差異為0.6%;9-44有6個株系,直鏈淀粉含量分別低于對照2.2%～3.5%,株系間差異為1.3%;11-43獨立轉(zhuǎn)化株9個花培株系的直鏈淀粉含量分別低于對照0.6%～4.2%,株系間的差異在0.2%～4.4%之間;而26-5有12個株系,7個株系籽粒呈蠟質(zhì)狀,AC<5.0%,5個株系12.9%>AC>14.3%,低于對照2.7%～3.1%,表現(xiàn)出明顯的分離。2.3多步法測定出峰谷特征和曲線趨勢圖1是同一獨立轉(zhuǎn)化株26-5花培后代和常規(guī)糯稻品種的RVA圖形。A曲線是AC>12.0%,籽粒外觀呈透明狀株系(粳)的曲線;B曲線是AC<5.0籽粒外觀呈蠟質(zhì)狀株系(糯)的曲線;C曲線是常規(guī)糯稻品種,AC<2.0%的曲線。A組和B組來源相同,但直鏈淀粉含量和籽粒外觀差異,曲線表現(xiàn)不同,不僅存在峰出現(xiàn)時間的差異,而且,存在著明顯不同的峰值。B組和C組,盡管籽粒外觀都呈蠟質(zhì)狀(糯),而曲線也表現(xiàn)不同,C組峰出現(xiàn)時間早,峰值也更低。由于26-5花培后代AC>11.0%株系數(shù)有限,不能全面反映該類籽粒外觀呈透明狀株系的RVA圖形,故比較了全部AC>11.0%株系的RVA曲線,結(jié)果表明:株系間存在峰谷高低的差異,但是,峰出現(xiàn)時間和曲線趨勢是相似的(圖2)。為了剖析直鏈淀粉含量對曲線趨勢的影響,將不同直鏈淀粉含量的株系分開,將直鏈淀粉含量接近對照的株系(15.0%～16.0%)為一組,將直鏈淀粉含量低于對照2%～3%的株系(11.5%～13.5%)為一組,比較各自的RVA曲線,結(jié)果顯示:除了株系間存在峰谷高低的差異外,還存在曲線趨勢的差異:11.5%>AC>13.5%組的曲線最終表現(xiàn)為逐步上升,但沒有超越第1個峰值。而15.0%>AC>16.0%組則相反,曲線最終表現(xiàn)為逐步上升,并高于第1個峰值(圖3、圖4)。2.4組療效比較采用新復極差法(LSR)對直鏈淀粉含量不同的三組株系(15.0%～16.0%,11.5%～13.5%,<5.0%)的RVA譜特征值進行多重比較(表2),結(jié)果表明:直鏈淀粉含量5%以下組株系,在8個特征值中,除崩解值和起漿溫度特征值較為接近外(與15.0%～16.0%組無顯著性差異,而與11.5%～13.5%組有顯著性差異),而其余6個特征值均明顯低于其它二組,差異都達到極顯著性水平。15.0%>AC>16.0%組,除崩解值、起降溫度外,各特征值最高;AC<5.0%組,各特征值最低;11.5%>AC>13.5%組居于二組中間(除崩解值和起漿溫度高于15.0%～16.0%組外)。經(jīng)差異顯著性測定,3個組彼此間熱漿黏度、冷膠粘度和消減值的差異達到極顯著性水平,回復值達到顯著性水平。15.0%～16.0%組與11.5%～13.5%組的崩解值和回復值達顯著性水平,而最高黏度、峰值時間和起降溫度則無顯著性差異。11.5%～13.5%組與直鏈淀粉含量低于5.0%組的崩解值和起漿溫度達顯著性水平。2.5最佳配方的建立為了分析直鏈淀粉含量與RVA譜各特征值的相互關(guān)系,以直鏈淀粉含量為因變量(Y),以RVA譜各特征值為自變量(X1～X8分別表示PKV、HPV、BDV、CPV、SBV、PeT、PaT、CSV),建立了多元回歸方程:Y=-6.647-0.285X1+0.68X2+0.873X3-0.4X4+0.623X5+3.515X6-0.046X7-0.155X8,得到F=57.298**>F0.01(8,25)=3.32,R=0.974**,達到極顯著水平。根據(jù)方程回歸系數(shù)絕對值的大小排列,各特征值與直鏈淀粉含量密切程度為:峰值時間(PeT)>崩解值(BDV)>熱漿黏度(HPV)>消減值(SBV)>冷膠黏度(CPV)>最高黏度(PKV)>回復值(CSV)>起漿溫度(PaT)。為了剔除各特征值對直鏈淀粉含量的干擾,建立了最優(yōu)化方程:Y=-9.562+0.053X5+3.743X6,得到F=210.164**>F0.01(2,31)=5.34,R=0.965**,達到極顯著水平。從建立優(yōu)化方程結(jié)果表明:峰值時間和消減值與直鏈淀粉含量關(guān)聯(lián)程度最為密切,兩者與直鏈淀粉含量均呈正相關(guān)。3對稻米品質(zhì)的分析稻米品質(zhì)評價有多個指標,直鏈淀粉含量是重要的理化指標之一。隨著分子生物學的發(fā)展和生物技術(shù)的進步,反義蠟質(zhì)基因的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化,不僅證明了能有效地降低稻米的直鏈淀粉含量,而且,通過轉(zhuǎn)化方法的改進和花藥培養(yǎng)技術(shù)的應用,已經(jīng)能快速獲得無抗性標記,直鏈淀粉含量降低穩(wěn)定的株系,這種技術(shù)進步為轉(zhuǎn)基因育種開辟了新的途徑。從理論上來講,水稻反義蠟質(zhì)基因的插入隨機,可望從不同的獨立轉(zhuǎn)化子后代中,篩選到直鏈淀粉含量不同的株系,但在實際的轉(zhuǎn)基因研究中,盡管在不同的粳稻和秈稻品種中已經(jīng)獲得了不少于250個獨立轉(zhuǎn)化子,在粳稻和秈稻中分別篩選到直鏈淀粉含量降低程度不同的株系,以及直鏈淀粉含量低于5.0%,籽粒呈蠟質(zhì)狀的株系。但是,始終沒有獲得直鏈淀粉含量在6.0%～10.0%范圍內(nèi)的粳稻株系,也沒有獲得直鏈淀粉含量在10.0%～14.0%范圍內(nèi)的秈稻株系(數(shù)據(jù)未列出)。其原因盡管可以用插入位置差異,出現(xiàn)頻率低來解釋,但更大可能與淀粉合成過程中其它相關(guān)的基因有關(guān)。稻米的糯和非糯區(qū)別,從形態(tài)上是以蠟質(zhì)狀和透明狀來劃分,從理化性質(zhì)上是以直鏈淀粉含量的高低來確定,直鏈淀粉含量在2%以下的為糯稻,本試驗所得到的部分株系籽粒呈蠟質(zhì)狀,從籽粒形態(tài)標準來看與典型的糯稻沒有區(qū)別。但是,從直鏈淀粉含量來判斷,含量在3.1%～4.0%的水平,不符合糯稻的標準,盡管其RVA譜圖形與常規(guī)糯稻趨勢相似,但其RVA譜各特征值還是存在明顯的差異,屬于極低直鏈淀粉含量的類型(3.0%～9.0%)。直鏈淀粉含量的測定,至今仍沿用傳統(tǒng)的方法,這不僅存在測定樣品有限,且還存在測定精度的問題。粘度速測儀的誕生,為稻米淀粉品質(zhì)測定提供了快速、準確的方法。通過RVA譜分析,可獲得與稻米品質(zhì)指標相關(guān)信息,從而可利用RVA測定來進行稻米品質(zhì)的輔助育種。以往的水稻RVA譜分析,主要集中于亞種間和品種間RVA譜特征值的比較,發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量與稻米黏滯特性有密切的關(guān)系。本研究則是建立在相同品種,反義蠟質(zhì)基因作用下,直鏈淀粉含量不同品系的基礎(chǔ)上,分析了直鏈淀粉含量與RVA譜的關(guān)系,雖然,存在著樣本數(shù)較少缺陷,但是,它有著以往其它實驗所不具備的優(yōu)點,即樣本的遺傳背景是相同的,除直鏈淀粉含量不同外,排除了其它遺傳差異對RVA譜的干擾。在直鏈淀粉含量與RVA譜特征值的多元回歸分析中,盡管冷膠黏度并不處于主導地位,但從不同直鏈淀粉含量株系的冷膠黏度值和RVA曲線,顯示出直鏈淀粉含量與冷膠黏度有密切的相關(guān)性,直鏈淀粉含量低的株系,冷膠黏度值都低于最高黏度值,RVA曲線上表現(xiàn)為第二峰低于第一峰。此外,由于冷膠黏度值的高低直接影響到消減值和回復值,在不同直鏈淀粉含量品種類群的RVA譜特征值比較中,也已觀察到低直鏈淀粉含量的日本品種群(15.7%左右),冷膠