奶牛布氏桿菌病的診斷與防治

奶牛布氏桿菌病的診斷與防治

草坪病，也被稱為狼病，是由腸球菌引起的自然流行病。該病可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物,引起相似的臨床癥狀與病理?yè)p傷,如發(fā)熱、流產(chǎn)、死胎、不育等,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,危害人類健康。家畜布氏桿菌病常發(fā)生于牛、豬、羊,是引起人類布氏桿菌病的主要傳染源。為此,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將布氏桿菌病列為B類動(dòng)物疫病,我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病,是國(guó)際貿(mào)易衛(wèi)生檢疫中必檢的傳染病。2008年10～12月份期間,某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)先后從天津、唐山、西安引進(jìn)奶牛258頭,與本地奶牛混群飼養(yǎng)。隨著奶牛的大量異地調(diào)運(yùn),該場(chǎng)布病疫情出現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)。2009年6月份至11月份,該場(chǎng)布病感染陽(yáng)性奶牛的比例從0.85%上升到5.89%;從2009年11月10日～2010年2月11日,在3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)感染牛群中44頭奶牛發(fā)生了流產(chǎn)、死胎。上述結(jié)果證實(shí),該規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了布氏桿菌野生強(qiáng)毒株的侵襲和蔓延。嚴(yán)峻的布病疫情不僅制約了奶牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,而且威脅著牛乳及其乳制品的安全,成為影響國(guó)計(jì)民生的一件大事。我國(guó)對(duì)家畜布氏桿菌病采取以檢疫凈化為主的綜合防控措施,同時(shí)包括對(duì)重點(diǎn)疫區(qū)的易感動(dòng)物接種疫苗,待臨床病例逐漸減少和疫情得到有效控制以后,再實(shí)施群體和地域的凈化。為此,該規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)布病陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離淘汰處理,對(duì)布病陰性牛(假定健康牛)進(jìn)行免疫接種?，F(xiàn)將奶牛群接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗的免疫效果報(bào)告如下。1材料和方法1.1內(nèi)使用—試劑、疫苗布病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和試管凝集試驗(yàn)抗原購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司,在有效期內(nèi)使用,按GB/T18646—2002規(guī)定的程序操作;S2株布氏桿菌活疫苗購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠,每瓶含布氏桿菌弱毒活菌4000億CFU,用生理鹽水稀釋疫苗,每頭奶?？诜臃N500億活菌劑量,以投藥器噴注到牛舌根及咽喉部免疫。1.2疫苗安全試驗(yàn)口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗以后,觀察奶牛群的疫苗接種反應(yīng),記錄疫苗接種前后一個(gè)月的泌乳牛產(chǎn)量。1.3服免疫對(duì)布病感染牛群控制排流率根據(jù)奶牛場(chǎng)的生產(chǎn)記錄,逐月統(tǒng)計(jì)疫苗接種前后能繁母牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎的病例數(shù),了解口服免疫對(duì)布病感染牛群控制流產(chǎn)率的效果;口服接種活疫苗以后15d、30d、45d、60d和90d,對(duì)免疫奶牛群按20%的比例隨機(jī)抽取血液樣本,定性(虎紅平板凝集試驗(yàn))和定量(試管凝集試驗(yàn))檢測(cè)血清中的布氏桿菌抗體水平,了解活疫苗誘導(dǎo)的抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。1.4pcr檢測(cè)omp25基因的擴(kuò)增10×PCRBuffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、D200DNAMarker等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1467—2007),從鮮乳樣本提取總DNA作為模板,針對(duì)布氏桿菌OMP25基因合成內(nèi)外兩對(duì)引物,采用嵌合式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增完成以后取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)以S2株布氏桿菌活疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照,滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為419bp的DNA條帶。2結(jié)果2.1泌乳牛和牛奶產(chǎn)量奶牛群接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗以后,均未觀察到任何接種反應(yīng),包括發(fā)熱、呼吸急促、食欲下降、流產(chǎn)和死胎等癥狀;接種疫苗前一個(gè)月泌乳牛產(chǎn)量達(dá)到13.65kg,接種疫苗后一個(gè)月泌乳牛產(chǎn)量為13.66kg,對(duì)牛奶產(chǎn)量沒(méi)有顯著的影響。結(jié)果表明S2株布氏桿菌減毒活疫苗口服接種是安全的。2.2接種疫苗之前是否能繁民法?2010年2月14日該奶牛場(chǎng)口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗,疫苗接種前后逐月統(tǒng)計(jì)能繁母牛的流產(chǎn)率,結(jié)果見(jiàn)圖1。接種疫苗以前3個(gè)月,布病感染奶牛場(chǎng)中能繁母牛的月平均流產(chǎn)率達(dá)到4.55%,2月上旬出現(xiàn)流產(chǎn)高峰(7.34%);接種疫苗以后,能繁母牛的月平均流產(chǎn)率降低至2.11%,目前控制在1%以下。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),S2株布氏桿菌減毒活疫苗能有效控制布病感染牛群流產(chǎn)、死胎率,減少能繁母牛因流產(chǎn)、死胎導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。2.3免疫牛檢測(cè)抗體水平奶牛群接種疫苗以后,定期采集血清樣本檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的抗體水平,結(jié)果見(jiàn)表1。奶牛接種疫苗以后15d,即可檢出疫苗誘導(dǎo)的布氏桿菌抗體,29.7%的免疫牛顯現(xiàn)虎紅平板凝集陽(yáng)性(血清學(xué)轉(zhuǎn)換);30d抗體水平達(dá)到高峰(36%);45～90d抗體陽(yáng)性率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)(31.1%→245%)。試管凝集定量檢測(cè)的抗體效價(jià)較低,5.6%～14%的血清樣本抗體效價(jià)為1:50;6.9%～10.8%的血清樣本抗體效價(jià)達(dá)到1:100以上。試管凝集試驗(yàn)測(cè)定的抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與虎紅平板凝集結(jié)果基本一致。監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗誘導(dǎo)形成的血清抗體水平較低,消失也較緩慢。2.4菌種omp實(shí)施嵌合式pcr檢測(cè)結(jié)果從接種疫苗的奶牛群不間斷隨機(jī)采集鮮乳樣本90份,按NY/T1467—2007規(guī)定的程序操作,針對(duì)布氏桿菌OMP25基因進(jìn)行嵌合式PCR擴(kuò)增。結(jié)果見(jiàn)圖2。S2株布氏桿菌活疫苗陽(yáng)性對(duì)照顯現(xiàn)一條約420bp的DNA條帶,滅菌雙蒸水空白對(duì)照不顯現(xiàn)任何條帶,4份被檢鮮乳樣本顯現(xiàn)一條約420bp的DNA帶,與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度相符合。檢測(cè)結(jié)果證實(shí),免疫奶牛鮮乳樣本中能夠檢出布氏桿菌核酸,檢出率為4.44%(4/90)。3布氏桿菌接種疫苗后存在的問(wèn)題3.1根據(jù)我國(guó)對(duì)牲畜布病疫情的監(jiān)測(cè)結(jié)果分析,在20世紀(jì)80年代以前,布病疫區(qū)主要集中在內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏和西藏五大牧區(qū);從20世紀(jì)90年代以后,牧區(qū)布病疫情依然嚴(yán)重,同時(shí)半農(nóng)半牧區(qū)和農(nóng)區(qū)省份的布病疫情明顯上升。2008年底,該規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)從天津、唐山、西安大量引進(jìn)奶牛,與本地牛群混合飼養(yǎng),導(dǎo)致了布病疫情的流行和蔓延。由于養(yǎng)殖場(chǎng)中奶牛的布病感染率和患病率較高,處于布病感染潛伏期的奶牛數(shù)量較大,現(xiàn)階段對(duì)布病重點(diǎn)疫區(qū)實(shí)施疫苗接種和檢疫撲殺的綜合防控策略。試驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)奶?？诜臃NS2株布氏桿菌減毒活疫苗是安全的,免疫接種能夠有效控制布病感染牛群發(fā)生流產(chǎn)、死胎的癥狀,減少由此導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。但是,疫苗接種只是一種權(quán)宜之計(jì),是目前控制重點(diǎn)疫區(qū)布病流行的一種方法。由于疫苗接種動(dòng)物與自然患病動(dòng)物無(wú)法甄別,一旦奶牛群接種活疫苗以后,法定檢疫措施嚴(yán)重受阻。另一方面,布氏桿菌是一種慢性胞內(nèi)寄生感染菌,疫苗活菌在動(dòng)物體內(nèi)殘存的時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)奶牛群構(gòu)成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),S2株活疫苗對(duì)人體具有一定的毒性,對(duì)奶牛場(chǎng)的飼養(yǎng)員、繁殖員和獸醫(yī)形成潛在的威脅。根據(jù)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院防制布病的經(jīng)驗(yàn),采用“S2株菌苗口服免疫為主的綜合性防制措施”,一年一次即可控制布病大面積流行,連續(xù)3年免疫可完全控制布病,通過(guò)加強(qiáng)檢疫、監(jiān)測(cè)和逐步淘汰,3～5年內(nèi)可實(shí)現(xiàn)奶牛場(chǎng)布病凈化的目標(biāo)。3.3OMP25存在于所有布氏桿菌中,是布氏桿菌主要外膜蛋白成分之一;OMP36主要存在于牛流產(chǎn)布氏桿菌(B.abortus)中,是構(gòu)成跨膜通道的膜孔蛋白;OMP31主要存在于羊馬爾它熱布氏桿菌(B.melitensis)中,在綿羊附睪型布氏桿菌(B.ovis)和犬布氏桿菌(B.canis)中表達(dá)量也相對(duì)較高。按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1467—2007規(guī)定的程序操作,針對(duì)布氏桿菌OMP25基因進(jìn)行嵌合式PCR擴(kuò)增,有利于提高樣本中布氏桿菌的檢出率,保證布氏桿菌核酸擴(kuò)增的屬特異性。溫富勇等采用布病乳汁環(huán)狀試驗(yàn)抗原檢測(cè)了86份免疫奶牛的鮮乳樣本,未檢出布氏桿菌特異性抗體,因此認(rèn)為乳汁是安全的;風(fēng)英等采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)鮮乳樣本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查,未分離到布氏桿菌,因此認(rèn)為布病陰性泌乳牛免疫后乳汁無(wú)排菌現(xiàn)象;本試驗(yàn)從布病陰性奶牛免疫后采集的鮮乳樣本檢出布氏桿菌核酸,檢出率為4.44%。關(guān)于疫苗接種奶牛是否存在乳汁排菌的風(fēng)險(xiǎn),各地學(xué)者持有不同的觀點(diǎn),有不同的報(bào)告結(jié)果,還有待于進(jìn)一步深入研究。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物布病防控研究室吳清明指出,在布魯氏病流行和防控技術(shù)研究對(duì)策中,應(yīng)增加動(dòng)物性食品布病病原體的基本檢測(cè)項(xiàng)目。近年來(lái)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始將多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)應(yīng)用于布氏桿菌核酸的檢測(cè)。在本試驗(yàn)檢出的4份陽(yáng)性鮮乳樣本中,是存在活的布氏桿菌還是死的布氏桿菌,是接種的減毒疫苗株還是流行的野生強(qiáng)毒株,目前尚不清楚,關(guān)于鮮乳樣本中布氏桿菌的分離培養(yǎng)與種型鑒定正在研究中。3.2奶牛接種布氏桿菌疫苗后,以誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫為主