復(fù)方斑膠囊血清對smmc-7721細胞蛋白質(zhì)組的影響

復(fù)方斑膠囊血清對smmc-7721細胞蛋白質(zhì)組的影響

雖然復(fù)方板的腫瘤機制非常獨特，但其在骨髓中的抑制作用非常好，同時對白細胞的轉(zhuǎn)化起到了很好的作用。但由于中藥多組分、多途徑、多靶點的作用特點,同時缺乏反應(yīng)中藥特色的研究思路和技術(shù)支撐,致使其作用機制的研究鮮見報道。本研究將中藥血清藥理學與蛋白質(zhì)組學相結(jié)合,摒棄方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),直接探索復(fù)方藥物對靶細胞的作用,利用中藥血清藥理學方法制備復(fù)方斑蝥膠囊血清處理SMMC-7721細胞來模擬口服抗癌藥體內(nèi)殺傷癌細胞過程,用蛋白質(zhì)組學技術(shù)觀察受藥物影響出現(xiàn)表達差異的蛋白質(zhì),通過對差異蛋白質(zhì)的鑒定,找出可能介導復(fù)方斑蝥膠囊作用的生物分子、作用靶點。本研究的目的旨在發(fā)現(xiàn)復(fù)方斑蝥膠囊抗肝癌的分子作用機制。1試劑和儀器人肝癌細胞株SMMC-7721由上海腫瘤研究所建株,重慶醫(yī)科大學感染實驗室惠贈。新西蘭大耳白兔,體重為(2.5±0.2)kg,雌雄不限,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(渝)20020001。低相對分子質(zhì)量蛋白標記物,丙烯酰胺,三羥甲基氨基甲烷,二硫蘇糖醇(DTT),硫脲,十二烷基硫酸鈉,甘氨酸,IPG干膠條(pH3~10,17cm),Bio-lyte(pH3~10)購自美國Bio-Rad公司;超純脲,四甲基乙二胺(TEMED),丙基硫酸鹽(CHAPS),苯甲基磺酰氟(PMSF),三氟乙酸(TFA),碘乙酰胺,a-氰基-4-羥基肉桂酸(CCA),AngiotensinⅡ(human),ACTHfragment18-39(human),考馬斯亮藍R-250,G-250購自Sigma公司;乙腈(ACN)色譜純購自Tedia公司,Trypsin購自Promega公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。復(fù)方斑蝥膠囊由重慶希爾安藥業(yè)有限公司惠贈,國藥準字ZI9993409,批號040901。美國Bio-Rad公司配套電泳儀:IPGphor等電聚焦儀、PROTEANⅡXLCell電泳系統(tǒng)、圖像分析軟件PDQuest7.3software,MultiTempⅢ水浴冷卻系統(tǒng)(美國AmershamPharmacia公司),基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間-質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)(美國ABI公司)。2方法2.1復(fù)方斑膠囊的制備人肝癌細胞SMMC-7721接種在含10%滅活的新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),每2~3d用0.1%胰酶消化傳代。處理組動物的臨床等效劑量的給藥劑量按下列公式計算。臨床等效劑量的動物給藥劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)(按體表面積計算)×培養(yǎng)體系血清稀釋度等效劑量系數(shù)=S兔/S人動物體表面積和體重之間的關(guān)系式:lgS=0.8762+0.698lgWS為體表面積(cm2),W為體重(g),人標準體重按70kg計算,試驗用兔體重為2.5kg,復(fù)方斑蝥膠囊的臨床用量為1500mg·d-1,培養(yǎng)體系血清稀釋度為10。用20mLPBS(pH7.4)將3倍臨床等效劑量的復(fù)方斑蝥膠囊內(nèi)容物制成混懸液,給藥組兔連續(xù)灌胃3d,于末次給藥后3h時刻以心臟采血法收集藥物血清,對照組兔連續(xù)灌以無藥PBS溶液3d,同法收集對照血清。同組血清混合,經(jīng)56℃30min滅活補體,0.22μm微孔濾膜過濾除菌于-20℃保存?zhèn)溆?。將含藥血清和對照血清用?0%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成10%的藥物血清孵育液和對照血清孵育液,并用此孵育液處理細胞72h后分別收集對照細胞和處理細胞,預(yù)冷PBS洗滌后離心去上清,重復(fù)3次,液氮凍融3個循環(huán),加入RNA酶(5μg·mL-1)和DNA酶(20μg·mL-1),4℃冰浴30min,再加入5倍細胞體積的裂解液(7mol·L-1尿素,2mol·L-1硫脲,4%CHAPS,40mmol·L-1Tris,65mmol·L-1DTT,1%Biolyte,1mmol·L-1PMSF)振蕩5min后,25000×g,4℃離心60min,收集上清液,Bradford法定量蛋白后-70℃保存。2.2sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳按Bio-Rad公司雙向電泳手冊進行,膠條選擇pH3~10,長度17cm的線性膠,蛋白質(zhì)上樣量為1000μg(350μL),膠條水化聚焦在17℃自動進行,經(jīng)被動水化14h,250V,1000V除鹽后線性升壓到1萬V,最后穩(wěn)定在1萬V聚焦達6萬V·h,再將膠條經(jīng)兩步平衡后轉(zhuǎn)移至12%的均勻膠上進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,10mA/gel恒流40min至溴酚藍完全跑出IPG膠條成一條線,再按40mA/gel恒流電泳至溴酚藍前沿達玻璃板底部停止,考馬斯亮藍R-250染色。2.3強化光催化作用染色凝膠采用NikonD100+AF-SNIKKOR17-35mm1∶2.8D數(shù)碼相機拍照,利用PDQuest7.3軟件產(chǎn)生吸光度圖像(makeAimage),經(jīng)強度校正、背景消減、點檢測,歸一化和匹配等分析。并根據(jù)吸光度的變化來判斷蛋白斑點表達量的變化,對復(fù)方斑蝥膠囊血清處理細胞和對照細胞的2-DE圖譜進行分析后,選取具有2倍以上量變的蛋白質(zhì)點作為進一步質(zhì)譜分析的候選蛋白。2.4tfa溶液配制將差異表達的蛋白質(zhì)點從膠上切下,經(jīng)50%ACN/25mmol·L-1碳酸氫銨水溶液脫色、ACN脫水至膠塊變白,真空離心干燥、Trypsin酶切16h后,用50%ACN/5%TFA水溶液萃取2次,將萃取液冷凍真空抽干后以3μL50%ACN/0.5%TFA水溶液復(fù)溶,加入過飽和基質(zhì)溶液3μL,混勻后取2μL點樣于不銹鋼靶板上,空氣自然干燥后備用。在MALDI-TOF-MS上進行分析,采用反向模式,正離子譜測定,離子源加速電壓為20kV,波長337nm,脈沖寬度為3ns,離子延遲提取70~85ns,真空度為4×10-8Torr,質(zhì)譜信號單次掃描累加50~100次,并用ABI公司提供的Mix1肽混合物C、AngiotensinⅡ和ACTHfragment18-39對照品為外標,胰酶自顯峰842.51、角蛋白峰1993.94為內(nèi)標校正質(zhì)譜峰,得到肽質(zhì)量指紋譜,采用Mascot搜索引擎搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫。3結(jié)果3.1維凝膠圖譜的建立利用雙向電泳分離藥物血清和對照血清處理72h的SMMC-7721的全細胞蛋白質(zhì),第一相用pH為3~10,長度為17cm的線性膠,第一相結(jié)束后進行SDS,考染后獲得二維凝膠圖譜。利用PD-quest7.3軟件分析共檢測到了大約450個點,藥物處理細胞和對照細胞蛋白質(zhì)圖譜間的相關(guān)性為72%,2倍以上量變的有47個點,差異蛋白點主要集中在pH4~7內(nèi)。3.2蛋白點表達情況根據(jù)圖像分析,選擇了13個差異點進行MALDI-TOF-MS分析,其中7個蛋白點(3,5,6,8,9,11,13)受藥物影響表達顯著上調(diào),其余6個蛋白點(1,2,4,7,10,12)表達顯著下調(diào)(圖1,2)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,有4個蛋白質(zhì)點得到了鑒定。數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果見表1。4復(fù)方斑膠囊的藥效根據(jù)前期試驗,選擇比較3倍臨床等效劑量連續(xù)給藥3d末次給藥3h的含藥兔血清處理72h的SMMC-7721細胞蛋白質(zhì)和對照細胞蛋白質(zhì)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),復(fù)方斑蝥膠囊作用癌細胞SMMC-7721導致真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)和硫氧還蛋白過氧化酶2(PRDX2)表達顯著下調(diào),膜聯(lián)蛋白A5(Annexinv)和熱休克70×103蛋白(HSP70)表達顯著上調(diào)。eIF-5A是目前已知唯一含hypusine(8-羥基2,7,10-三氨基癸酸)的細胞內(nèi)蛋白質(zhì),是維持細胞生存必不可少的成分。在低分化、12/13密碼子K-ras突變、p53核蓄積的腫瘤中發(fā)現(xiàn)有eIF-5A高表達。它被認為是抗腫瘤治療的重要靶標之一。在研究α干擾素誘導人表皮咽癌KB細胞和肺H1355癌細胞系凋亡時發(fā)現(xiàn)GC7(eIF-5A滅活物)對其有協(xié)調(diào)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)利用DAH(eIF-5A的滅活物)處理白血病細胞系Mo7e,TF-1和THP-1和人乳腺癌細胞系MCF-7可誘導細胞凋亡阻滯在G1-S期的分界。前期的研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方斑蝥膠囊血清誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡阻滯在G0-G1期,可能與該藥靶向下調(diào)eIF-5A的作用有關(guān)。PRDX2是作用在Bcl-2的上游的抗凋亡蛋白,能夠阻止細胞中過氧化氫蓄積、抑制細胞色素C從線粒體釋放到胞漿并能抑制磷脂過氧化反應(yīng),保護細胞抵抗血清饑餓、神經(jīng)酰胺、鬼臼乙叉苷等誘導的凋亡。本研究中藥物處理細胞出現(xiàn)PRDX2表達下調(diào)與前期證實的處理組細胞出現(xiàn)Bcl-2表達下調(diào)的結(jié)論相一致,說明下調(diào)PRDX2可能是復(fù)方斑蝥膠囊促進癌細胞凋亡的機制之一。Annexinv是抗腫瘤增殖的一種蛋白質(zhì),其通過抑制蛋白激酶C(PKC)和磷脂酶A2而發(fā)揮抗增殖作用,抑制PKC的活化還可對抗由于PKC活化而加速P-糖蛋白的磷酸化所致的腫瘤細胞多藥耐藥的發(fā)生與發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)處理組細胞中Annexinv表達明顯上調(diào),表明復(fù)方斑蝥膠囊不僅能夠抗腫瘤增殖,還可通過抑制耐藥性的產(chǎn)生提高自身及其他聯(lián)用藥物的抗腫瘤活性。關(guān)于HSP70蛋白,目前有兩種不同的觀點,一種認為它是抗凋亡蛋白,可與多種癌基因產(chǎn)物結(jié)合形成HSP70-癌蛋白復(fù)合物,從而介導癌蛋白構(gòu)象成熟及轉(zhuǎn)運,維持癌細胞結(jié)構(gòu)與功能的完整。但亦有文獻證實誘導HSP70高表達能夠阻止促炎癥反應(yīng)抗凋亡因子——NF-kappa-B的活化和核轉(zhuǎn)運,通過增強抗腫瘤免疫的能力從而促進癌細胞凋亡。本研究中處理組細胞出現(xiàn)HS