艾灸對胃黏膜細胞凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

艾灸對胃黏膜細胞凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

近年來的研究表明，針灸可以誘導(dǎo)70例熱休克蛋白（hbs70）的出現(xiàn)，并對胃粘膜產(chǎn)生保護作用。它不僅可以抗損傷，還可以促進潰瘍的修復(fù)和愈合，這與細胞疾病的關(guān)系初步探討。針灸血清的研究表明,將針灸血清回輸?shù)絼游矬w內(nèi)具有針灸治療的類似作用;同種異體離體實驗和異種異體離體實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)針灸血清培養(yǎng)的效應(yīng)細胞其活性可明顯增強;離體混合實驗證明經(jīng)針灸血清培養(yǎng)過的效應(yīng)細胞回輸?shù)絼游矬w內(nèi),其作用強度較未經(jīng)針灸血清培養(yǎng)的細胞明顯提高;甚至有人已經(jīng)從針刺治療哮喘大鼠的血清中發(fā)現(xiàn)了某些特異蛋白質(zhì)。提示針灸血清中含有針灸作用的效應(yīng)因子,這為針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究借鑒針灸血清學(xué)方法,將艾灸人體穴位后提取的血漿作用于乙醇損傷的離體人胃黏膜上皮(GES-1)細胞,觀察艾灸血漿是否能誘導(dǎo)細胞內(nèi)HSP70的產(chǎn)生,抑制細胞凋亡,試圖從細胞水平揭示艾灸對胃黏膜細胞的保護作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,為針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供一定實驗依據(jù)。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器DMEM高糖(Gibco,美國)、小牛血清(湘雅醫(yī)學(xué)院實驗中心自制)、EDTA和MTT(Sigma,美國)、半胱氨酸天冬酸蛋白酶(Caspase)-3及Caspase-9(博士德,武漢)、碘化丙啶(Sigma,美國)、一抗兔抗人HSP70(博奧森,北京)、第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活物(Smac,博奧森,北京)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF,博奧森,北京)、羊抗鼠辣根過氧化物酶抗體及SABC試劑盒即用型(博士德,武漢)、純艾條(漢醫(yī)牌,南陽)、細胞培養(yǎng)板(Corningcostar,美國)、CO2培養(yǎng)箱(三洋,日本)、倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)、酶標(biāo)儀(TECAN,奧地利)、流式細胞儀(COULTEREPICSXL,BECKMAN,美國)。1.2細胞起源GES-1購自湘雅醫(yī)學(xué)院實驗中心。1.3艾氏穴和艾非穴位組對血漿來源:湖南中醫(yī)藥大學(xué)在校健康大學(xué)生24名(男、女各半),年齡18～25周歲,排除女性月經(jīng)周期、妊娠或哺乳期,經(jīng)常規(guī)體檢及血、尿常規(guī)檢查無異常,愿意接受本實驗方案。將24名學(xué)生隨機分為艾灸穴位組及艾灸非穴位組,每組12名(男、女各半)。艾灸穴位組溫和灸中脘、關(guān)元和雙側(cè)足三里穴。非穴位組艾灸平行于中脘、關(guān)元穴右側(cè)3寸非穴位點,及平行于足三里穴內(nèi)側(cè)1寸非穴位點。兩組均每日灸30min,連續(xù)灸10d。于艾灸前及艾灸后(第11天)早上7點至8點抽取空腹靜脈血。血漿制備:使用真空負壓采血管采取空腹靜脈血8mL,按10∶1比例加入1.5%EDTA抗凝,離心(3000r/min,15min),每例吸取血漿1mL,將艾灸前后所得血漿按組別分別等量混合分裝,-80℃保存。1.4co培養(yǎng)箱傳代細胞培養(yǎng):GES-1細胞株用DMEM培養(yǎng)基加10%的小牛血清在標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天換液,約90%滿瓶時傳代。細胞損傷模型的制作:在GES-1細胞培養(yǎng)液中加入8%的乙醇作用3h,造成GES-1細胞損傷,經(jīng)MTT(噻唑藍)檢測使細胞抑制率達到30%左右。1.5ges-1細胞在不同組中的培養(yǎng)將實驗細胞分為空白組、模型組、艾灸穴位血漿組、艾灸非穴位血漿組。處理過程如下:①取對數(shù)生長中期細胞,調(diào)整細胞密度為4×104/mL,按照每孔3mL接種入6孔板細胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48h,PBS洗2次,用不完全培養(yǎng)基同步24h,PBS洗2次。②將GES-1細胞分為以上4組,每組35孔。空白組加入完全培養(yǎng)基3mL培養(yǎng)3h后,吸棄培養(yǎng)基,PBS洗2次;其余3組加入含8%乙醇培養(yǎng)基3mL培養(yǎng)3h后,吸棄培養(yǎng)基,PBS洗2次。③空白組、模型組加入含10%艾灸前人體血漿DMEM培養(yǎng)液3mL;艾灸穴位血漿組、艾灸非穴位血漿組分別加入含10%艾灸穴位血漿及含10%艾灸非穴位血漿培養(yǎng)基3mL。各組細胞于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集細胞待做相關(guān)標(biāo)本檢測。1.6細胞凋亡檢測細胞凋亡檢測:每組隨機選取4孔,測定4樣本(即n=4)。將細胞移入離心管;3000r/min離心10min,棄上清液;每管2mLPBS洗滌,2500r/min離心5min,棄上清液,重復(fù)2次;向離心管中加入500μL70%冰乙醇,重懸細胞,移入1.5mLEP管,再次洗滌離心管后移入EP管,得1mL樣本液;將細胞固定在4℃、24h以上;將固定后的細胞用PBS洗2遍(3000r/min,1min),加入100μLPBS,0.66μLRNaseA(1mg/mL),37℃孵育30min;加入0.4mL50μg/mL碘化丙啶,避光染色20min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡,每份樣品獲取104以上細胞,用MCYCLE(PhoenixFlowSystems,Inc.USA)軟件分析細胞凋亡率。HSP70、Smac、AIF蛋白表達檢測:任取4孔合并為1個測定樣本,每組5個樣本(即n=5)。在收集上清液后,用PBS沖洗1次,吸棄PBS,胰蛋白酶消化并收集細胞,-80℃保存。檢測時加入細胞裂解液,4℃12000r/min離心10min,取上清液,Bradford法行蛋白含量測定。制備的蛋白樣本進行SDS凝膠電泳,電泳后用電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,一抗分別為HSP70、Smac、AIF抗體,二抗為羊抗鼠辣根過氧化物酶的抗體。利用ECL化學(xué)發(fā)光法進行顯色反應(yīng),檢測結(jié)果以X光膠片曝光。用ImagerQuant400(GEHealthcare,USA)成像系統(tǒng)軟件對Western-blot條帶進行灰度掃描,以目的蛋白與β-actin面積灰度值的比值作為各指標(biāo)蛋白表達量的參數(shù)。Caspase-3、9表達檢測:細胞分組及樣本處理同前,每組5個樣本(n=5)。以4%多聚甲醛固定,將固定好的細胞玻片以30%的H2O21份+50份甲醇混合液室溫浸泡30min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗5min×2次;滴加5%小牛血清封閉液封閉20min,分別滴加小鼠抗人Caspase-3、Caspase-9單克隆抗體,4℃下靜置過夜,正常血清代替一抗作為陰性對照;PBS洗3次,滴加生物素化二抗工作液(兔IgG),37℃孵育20min,PBS洗2min×3次;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,37℃下孵育30min;蒸餾水洗3次,3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10～20min,乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,置顯微鏡下觀察。每個標(biāo)本觀察3張片子,每張片子取5個視野分析細胞陽性著色范圍和程度,陽性為光學(xué)顯微鏡下背景不顯色,細胞質(zhì)內(nèi)著棕黃色顆粒。以Image-ProPlus6.0(MediaCyberneticsInc.USA)圖片分析軟件分析測定其吸光度(OD),取其平均值。1.7算法的基本思想計量資料實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。組間比較,符合正態(tài)分布者,采用單因素方差分析,方差齊者用LSD或SNK法,方差不齊者用Tamhane’sT2或Dunnett’sT3法;不符合正態(tài)分布者,采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1g峰之前是否有ap峰用碘化丙啶染色后凋亡細胞由于細胞內(nèi)DNA斷裂成小片段而漏出,檢測時在正常二倍體細胞DNA峰(G峰)之前出現(xiàn)一小峰,稱Ap峰(圖1)。根據(jù)Ap峰的高低可以推測細胞凋亡率。圖1空白組G峰之前未見明顯Ap峰;模型組可見在G峰之前有一小峰(Ap峰),對應(yīng)凋亡率為7.418%;艾灸穴位血漿及艾灸非穴位血漿組可見該峰低于模型組,凋亡率分別為1.238%及1.565%。圖1顯示模型組與空白組比較凋亡率明顯增加(P<0.01);艾灸穴位血漿組及艾灸非穴位血漿組與模型組比較凋亡率下降(P<0.01),提示艾灸穴位及艾灸非穴位血漿均能降低受損細胞凋亡率;艾灸非穴位血漿組凋亡率高于艾灸穴位血漿組(P<0.01),表明艾灸穴位血漿在對抗細胞凋亡方面優(yōu)于艾灸非穴位血漿。2.2凋亡誘導(dǎo)因子圖2顯示,模型組與空白組比較,細胞內(nèi)HSP70、Smac、AIF表達均上調(diào)(P<0.01),表明乙醇造成的細胞損傷能誘導(dǎo)HSP70表達,提高促凋亡因子Smac及凋亡誘導(dǎo)因子AIF水平;與模型組比較,艾灸穴位血漿組HSP70表達進一步提高(P<0.01),Smac及AIF含量降低(P<0.01),艾灸非穴位血漿組Smac也出現(xiàn)下降(P<0.01)。與艾灸穴位血漿組比較,艾灸非穴位血漿組HSP70表達較低(P<0.01),Smac及AIF含量較高(P<0.01),提示艾灸穴位血漿組在上調(diào)HSP70表達、減低促凋亡因子及凋亡誘導(dǎo)因子含量方面優(yōu)于艾灸非穴位血漿組。2.3艾爾巴穴血漿對caspase-3、9的影響圖3顯示,各組細胞內(nèi)有棕黃色顆粒即Caspase-3、9蛋白陽性表達,空白組呈弱陽性表達,模型組較空白組棕黃色顆粒表達明顯增強,艾灸穴位及非穴位血漿組Caspase-3、9蛋白表達較模型組顯著減少。模型組與空白組比較Caspase-3、9明顯上調(diào)(P<0.01);艾灸穴位血漿組Caspase-3、9高于空白組(P<0.01),但低于模型組(P<0.01);艾灸非穴位血漿組Caspase-3、9高于空白組(P<0.01)和艾灸穴位血漿組(P<0.05,P<0.01),低于模型組(P<0.05,P<0.01)。提示乙醇造成細胞損傷后,GES-1細胞內(nèi)Caspase-3、9明顯上調(diào),艾灸穴位血漿能使上調(diào)的Caspase-3、9出現(xiàn)下降,艾灸非穴位血漿組對Caspase-3、9下調(diào)也有一定作用,但其作用程度比艾灸穴位血漿組低。3促凋亡的作用機制臨床實踐證實艾灸對消化系統(tǒng)疾病有著良好療效,實驗研究也證明艾灸能減輕胃黏膜損傷。本課題組在艾灸對胃黏膜保護作用方面進行了長期大量的研究,分別從艾灸對胃黏膜血流量的影響,對內(nèi)源性保護因子前列腺素、降鈣素基因相關(guān)肽、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子的合成和釋放,對胃黏膜細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用等方面探討了各種因素造成胃黏膜損傷狀態(tài)下,艾灸對胃黏膜細胞保護的作用機制。近期發(fā)現(xiàn)艾灸對胃黏膜的保護作用與其誘導(dǎo)HSP70的表達有關(guān),通過線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細胞凋亡,達到保護胃黏膜的作用。HSP70是在生物體中普遍存在的一組高度保守的蛋白質(zhì),能在應(yīng)激情況下迅速合成,以分子伴侶的功能參與腫瘤免疫,抗細胞凋亡,提高細胞的應(yīng)激耐受性等。研究表明,針灸可以調(diào)節(jié)組織細胞HSP70及其基因的表達,啟動機體內(nèi)在的抗病與應(yīng)變能力,增強抗損傷及應(yīng)激保護能力。文獻證實HSP70通過線粒體通路對細胞凋亡起調(diào)控作用。它能抑制應(yīng)激所致的細胞色素C從線粒體的釋放,減少凋亡蛋白酶活化因子及Caspase-9的活化,進而抑制Caspase-3活化及隨后的細胞凋亡等。線粒體釋放的第二種Caspase激活物Smac是一種促凋亡分子,在凋亡誘導(dǎo)因子的作用下,與凋亡抑制蛋白結(jié)合并解除其對Caspase的抑制作用,從而使Caspase-3、9活性增強,促進細胞凋亡發(fā)生。蔣氏等發(fā)現(xiàn)HSP70能抑制Smac從線粒體向胞質(zhì)的釋放及對Caspase-3的激活,從而抑制細胞凋亡發(fā)生,認(rèn)為在一定程度上Smac從線粒體的釋放是決定細胞凋亡還是生存的重要因素。AIF具有自激活的能力,當(dāng)細胞受到外界因素刺激,從線粒體釋放AIF進入胞質(zhì),胞質(zhì)中的AIF能夠刺激更多的線粒體AIF釋放進入胞質(zhì),形成自加強回路,可直接誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗結(jié)果表明,艾灸中脘、關(guān)元和足三里穴位后提取的人體血漿能抑制細胞凋亡,促進細胞內(nèi)HSP70合成和高表達,同時出現(xiàn)促凋亡誘導(dǎo)因子Smac、AIF表達的抑制和Caspase-9、Caspase-3表達下降。以上結(jié)果從細胞水平證實艾灸對胃黏膜細胞的保護作用機制主要與其誘導(dǎo)熱休克蛋白,通過線粒體凋亡通路抑制細胞凋亡有關(guān)。實驗結(jié)果顯示艾灸非穴血漿對細胞凋亡率及Smac、Caspase-9、Caspase-3等也有一定作用,但艾灸血漿的作用明顯強于艾灸非穴位血漿作用,說明艾灸人體血漿對胃黏膜上皮細胞保護作用具有一定的穴位特異性。針灸血漿是指從刺灸處理后的人或動物體上采集到的血漿,作為效應(yīng)物質(zhì)加到另一個反應(yīng)系統(tǒng)中,同在體或離體器官、組織、細胞或分子等靶目標(biāo)接觸,通過它們的功能或形態(tài)學(xué)的改變,可觀察到針灸處理后血漿產(chǎn)生的效應(yīng),其思路來源于“針灸血清”和賀石林的“血漿藥理學(xué)”方法。血清是血液凝固后除去纖維蛋白與血細胞的液體部分,血漿指抗凝血液離心后去除血細胞的上清液。由于血清不含纖維蛋白原、凝血酶,且有凝血、抗凝、纖溶、補體等多個系統(tǒng)的活化,故有學(xué)者提出在實驗中應(yīng)盡量選擇使用血漿,而不使用血清。賀龍剛等觀察丹參注射液的含藥血清和血漿對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響,評價兩者差異,發(fā)現(xiàn)含藥血漿組促進雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用強于其血清對照組。王東生等對大黃蟲丸含藥血漿與血清進行比較,發(fā)現(xiàn)含藥血漿抑制血小板聚集作用顯著優(yōu)于含藥血清。據(jù)此本研究嘗試采用艾灸血漿作為效應(yīng)物質(zhì)加到受損細胞中觀察其對胃黏膜細胞損傷的干預(yù)作用,發(fā)現(xiàn)艾灸特定穴位后提取的血漿對損傷的離體胃黏膜細胞具有抗凋亡效應(yīng)。近年來不少研究已證實針灸血清具有抗哮喘作用和體液調(diào)節(jié)功能,還具有改善免疫功能及抗衰老作用等。陳漢平等提出:“針灸血清”之所以具有和藥物相類似的作用,關(guān)鍵在于刺灸腧穴后,可