dmem凍存液對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響

dmem凍存液對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響

家蠶和胚胎的冷凍保存技術(shù)為畜牧業(yè)帶來了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。生殖細(xì)胞是動(dòng)物物種生存、進(jìn)化和變異的基礎(chǔ),隨著生殖細(xì)胞的體外培養(yǎng)、異體移植及遺傳操作技術(shù),以及體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)等各項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,各類生殖細(xì)胞的冷凍保存對(duì)于動(dòng)物種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存及開發(fā)利用具有重要意義。目前,除精液冷凍保存研究及應(yīng)用較為深入和廣泛外,其余各分化階段的生殖細(xì)胞以及生殖組織、器官的冷凍保存研究報(bào)道較少,資料缺乏。除少數(shù)幾種動(dòng)物睪丸單細(xì)胞冷凍保存有報(bào)道外,哺乳動(dòng)物生精小管及睪丸組織塊的冷凍保存在國內(nèi)外報(bào)道極少。本研究在DMEM/10%NBS中添加10%DMSO,對(duì)7日齡小鼠生精小管及完整睪丸進(jìn)行冷凍保存、測(cè)定細(xì)胞復(fù)蘇率,探討7日齡小鼠生精小管及完整睪丸的冷凍保存方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～7日齡雄性昆白系仔鼠。1.2dmem、dibco小牛血清(NBS,Gibco),DMEM(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),二甲基亞砜(DMSO,天津市化學(xué)試劑一廠,分析純)。1.3冷凍溶液的制備在DMEM培養(yǎng)液中添加10%DMSO,10%NBS及50μg/mL雙抗,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4細(xì)胞復(fù)蘇率的測(cè)定7日齡雄性仔鼠被處死后,迅速從其體內(nèi)無菌取出睪丸,置預(yù)先加有適量PBS(pH7.4)的培養(yǎng)皿中,去白膜后PBS吹打,清洗3次以去除間質(zhì)組織;800r/min離心3min收集生精小管;加入15倍體積凍存液后,移入1.5mL冷凍管,置-70℃冰箱內(nèi)過夜,次日將冷凍管移入液氮,保存1周至半年。復(fù)蘇時(shí),從液氮中取出冷凍管,空氣中停留片刻,投入37℃水浴至溶解;用PBS離心(800r/min,3min)洗滌生精小管2次;10倍體積0.25%胰蛋白酶34℃消化10～15min,其間吹打數(shù)次;DMEM/10%NBS終止消化,800r/min,3min離心洗滌細(xì)胞2次;1%臺(tái)盼藍(lán)染色5min,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下隨機(jī)取數(shù)個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)死、活細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞圓而透明,臺(tái)盼藍(lán)拒染者為活細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色者為死細(xì)胞,每個(gè)樣統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)不低于1000個(gè)),計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇率。以生精小管單細(xì)胞的復(fù)蘇率為對(duì)照(冷凍保存方法見參考文獻(xiàn)。1.5睪丸的制備7日齡雄性仔鼠被處死后,迅速從其體內(nèi)無菌取出睪丸,放入預(yù)先加有適量PBS的培養(yǎng)皿中;將睪丸清洗后移入1.5mL冷凍管中,加入15倍體積的凍存液;將冷凍管置-70℃冰箱內(nèi)過夜,次日移入液氮,保存1周至半年。復(fù)蘇時(shí),從液氮中取出冷凍管投入37℃水浴至溶解,用適量PBS洗滌睪丸3次后,撕去白膜,PBS吹打,800r/min,3min離心洗滌2次;隨后的消化、染色、計(jì)數(shù)及計(jì)算方法同前。2不同的細(xì)胞損失率,細(xì)胞復(fù)蘇率結(jié)果見表1新鮮分離的生精小管單細(xì)胞的活細(xì)胞率為(97.4±0.6)%。7日齡小鼠生精小管及完整睪丸冷凍保存后的細(xì)胞復(fù)蘇率分別為(87.3±2.6)%和(85.0±3.4)%,兩復(fù)蘇率之間差異不顯著(P>0.05);與對(duì)照組單細(xì)胞復(fù)蘇率相比,均差異不顯著(P>0.05);7日齡小鼠生精小管及完整睪丸冷凍保存過程中的細(xì)胞損失率分別為10.1%和12.4%。7日齡小鼠生精小管及完整睪丸凍存后細(xì)胞復(fù)蘇率可達(dá)85.0%以上,此結(jié)果顯示在慢速冷凍時(shí),DMSO有足夠的時(shí)間和速度滲入到生精小管的各部,從而起到保護(hù)作用;對(duì)于7日齡小鼠完整睪丸,由于其體積小(約0.2cm×0.2cm×0.25cm),盡管有結(jié)締組織白膜包裹,但對(duì)DMSO的滲透并無較大妨礙,DMSO也能及時(shí)滲入到內(nèi)部而起到保護(hù)作用。在復(fù)蘇時(shí),因睪丸體積小,其內(nèi)部能夠及時(shí)復(fù)溫,使細(xì)胞盡快度過有害溫度區(qū)以減少細(xì)胞死亡。本研究表明,采用含10%DMSO凍存液,兩步慢速冷凍,液氮保存,37℃水浴復(fù)蘇是保存7日齡小鼠生精小管和完整睪丸的一種適宜的冷凍保存方法。3不同冷凍保存方法對(duì)7日齡仔鼠生精小管原代克氏原螯蝦細(xì)胞復(fù)蘇率的影響目前,生物體成功的低溫保存多采用所謂的慢速冷凍,具體步驟是:先將細(xì)胞放入含有抗凍劑的溶液中進(jìn)行預(yù)處理,接著用程序降溫儀將上述細(xì)胞連同溶液以較慢的速度降溫,降到一定的低溫時(shí),再快速降溫至液氮溫度,并長(zhǎng)期保存在此溫度下。慢速冷凍保存法的研究手段有兩種:理論分析法和實(shí)驗(yàn)研究法。前者雖未從根本上解決問題,但卻給降溫程序的制定和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供有用的指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)研究法,針對(duì)不同細(xì)胞使用不同抗凍劑,采用不同降溫、復(fù)溫程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn),然后根據(jù)復(fù)溫后細(xì)胞的存活率來判斷這種低溫保存程序是否有效。根據(jù)冷凍效果研究,從7日齡小鼠睪丸分離得到的單細(xì)胞,在慢速冷凍時(shí),10%DMSO為效果較佳的抗冷凍劑濃度,細(xì)胞復(fù)蘇率可達(dá)89.4%,據(jù)此采用10%DMSO凍存液,對(duì)7日齡小鼠生精小管及完整睪丸進(jìn)行冷凍保存,測(cè)定細(xì)胞復(fù)蘇率。7～8日齡小鼠生精小管索的生精上皮中僅含精原細(xì)胞(27%)和支持細(xì)胞(Sertolicell,73%),此時(shí)的精原細(xì)胞比例最高,此后隨日齡增長(zhǎng),盡管精原細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加,但比例下降。精原細(xì)胞在體內(nèi)適宜的條件下能進(jìn)一步發(fā)育形成精子細(xì)胞,進(jìn)而成熟為精子。在體外培養(yǎng)條件下,精原細(xì)胞同樣要求有支持細(xì)胞與之形成特定的功能性結(jié)構(gòu),才能繼續(xù)發(fā)育形成精子細(xì)胞。生精小管的冷凍保存可以保證精原細(xì)胞處于其原有的功能性結(jié)構(gòu)狀態(tài),因此,與單細(xì)胞冷凍保存相比,生精小管和睪丸的冷凍保存顯得更具有其獨(dú)特的價(jià)值。各種哺乳動(dòng)物在胎兒及幼齡時(shí)期生精小管的結(jié)構(gòu)都經(jīng)歷相似的發(fā)育過程,其中的精原細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面也非常相似,因此,