實驗三食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗

實驗三食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗第1頁，本講稿共31頁（一）蠟樣芽胞桿菌生物學(xué)性狀

1、形態(tài)和染色特性該菌為革蘭氏陽性的大桿菌，菌體兩端較平整，芽胞呈橢圓形，位于菌體中央稍偏一端,多呈鏈狀排列,無莢膜，有周鞭毛。第2頁，本講稿共31頁2、培養(yǎng)特性（1）需氧菌，生長溫度范圍在10-45℃之間。最適生長溫度為28-35℃。

（2）在普通培養(yǎng)基上生長良好。本菌在普通瓊脂平板上，生長的菌落呈乳白色，不透明，直徑4-6mm,邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。第3頁，本講稿共31頁（3）在血液瓊脂平板上形成淺灰色、不透明、似毛玻璃狀的菌落。菌落周圍初呈草綠色溶血,時間稍長即完全透明。（4）蠟狀芽胞桿菌在甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)上的菌落為粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有粉紅色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。第4頁，本講稿共31頁（5）在普通肉湯內(nèi)生長迅速，肉湯混濁，常常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。第5頁，本講稿共31頁3、生化性狀：（1）葡萄糖發(fā)酵試驗：接種于酚紅葡萄糖肉湯中，厭氧條件下35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基應(yīng)由紅色變?yōu)辄S色。（2）硝酸鹽還原試驗：陽性（紅色）。（表明本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸）（3）V-P試驗：接種于改良V-P培養(yǎng)基中，35℃

培養(yǎng)48h。加V-P試劑及肌酸數(shù)粒，靜止

1h，應(yīng)為陽性反應(yīng)（伊紅色）。第6頁，本講稿共31頁（4）L-酪氨酸分解試驗：接種于L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)48h,陽性反應(yīng)菌落周圍培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)（表示產(chǎn)生酪蛋白酶）。陰性時應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)72h再觀察。（5）溶菌酶試驗：用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán),接種于溶菌酶肉湯中，35℃培養(yǎng)24h。該菌在本培養(yǎng)基（含0.001％的溶菌酶）中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng),應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。第7頁，本講稿共31頁4、致病性

蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒，除必須具有大量的細(xì)菌外，腸毒素也是重要的致病因素。耐熱性腸毒素：100℃30分鐘不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素,常在米飯中形成。不耐熱腸毒素：是引起腹瀉型胃腸炎的病因，能在各種食物中形成。第8頁，本講稿共31頁5、抵抗力蠟樣芽胞桿菌100℃20分鐘即可被殺死；對酸堿不敏感，pH6-11對本菌基本上不受影響，pH5以下，生長可受到抑制。第9頁，本講稿共31頁（二）流行病學(xué)特點1、季節(jié)性特點：以夏、秋季，尤其是6～10月為多見。2、食品種類－剩飯，特別是大米飯。－乳及乳制品、畜禽肉類制品、蔬菜、萊湯、馬鈴薯、豆芽、甜點心、調(diào)味汁、色拉。

國內(nèi)：與淀粉質(zhì)食品相關(guān)多。第10頁，本講稿共31頁3、臨床癥狀

嘔吐型中毒：多見于過剩米飯和油炒飯，由耐熱性腸毒素為致病因素；潛伏期短，一般為2～3小時，最短為30分鐘，最長5～6小時；癥狀以嘔吐，腹痙攣為主，腹瀉則少見，一般經(jīng)過8～10小時而治愈。

腹瀉型中毒：由各種食品中不耐熱腸毒素引起，潛伏期在6小時以上，一般為6～14小時；癥狀以腹瀉，腹痙攣，而嘔吐卻不常見；病程24～36小時。第11頁，本講稿共31頁1.蠟樣芽孢桿菌檢驗程序：檢樣25g(ml)+225ml生理鹽水中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗GB/T4789.28-2003做成10-1-10-5的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測定）MYP選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）MYP37℃，18h-24h菌數(shù)計算營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基36℃

±1℃12h~20h36℃

±1℃12h~20h生長及菌落觀察染色鏡檢生化試驗菌株保存報告（三）檢測方法第12頁，本講稿共31頁10-1~10-5的稀釋液的制備

每個稀釋度0.1mL接種于2個MYP培養(yǎng)基36±1℃

12~20h菌落計數(shù)36±1℃

12~20h挑取菌落接種肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）證實試驗報告形態(tài)觀察染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性生化分型第13頁，本講稿共31頁

2．菌數(shù)測定以無菌操作將檢樣25g或25ml按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1～10-5的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用L形棒涂布于整個表面，置37℃培養(yǎng)12～20h后，選取菌落數(shù)在30個左右者進行計數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。第14頁，本講稿共31頁計數(shù)后，從中挑取5個這樣的菌落作證實試驗。根據(jù)試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該培養(yǎng)皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。第15頁，本講稿共31頁計數(shù)后，從中挑取5個此種菌落做證實試驗，根據(jù)證實的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該平板上的菌落數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)，即得每克（毫升）樣品中所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)。例如將0.1mL10-4樣品稀釋液涂布于MYP平板上，其可疑菌落為25個，取5個鑒定，證實四個菌落為蠟樣芽孢桿菌，則1g（mL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)為：選取具有15-150個典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板,進行計數(shù)。計算同一稀釋度兩個平板的平均菌落數(shù)。25×4/5×104×10＝2×106第16頁，本講稿共31頁

3．分離培養(yǎng)將檢樣或其稀釋液劃線于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置37℃培養(yǎng)12～20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然后做證實試驗。

第17頁，本講稿共31頁4．證實試驗（1）形態(tài)觀察本菌應(yīng)為G＋桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。（2）培養(yǎng)特性本菌在肉湯中生長混濁，常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀且邊緣不齊。第18頁，本講稿共31頁

（3）生化特性本菌有動力；產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；能液化明膠和還原硝酸鹽；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。第19頁，本講稿共31頁(4)生化分型根據(jù)蠟樣芽孢桿菌對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化的試驗，分成不同型別，見表1。第20頁，本講稿共31頁表1蠟樣芽孢桿菌生化分型型別生化試驗檸檬酸鹽利用硝酸鹽還原淀粉水解V-P反應(yīng)明膠液化123456789101112131415＋－＋－－＋＋－－－＋＋－＋＋＋＋＋－－－－＋＋＋＋＋－－－＋＋－＋－－＋－－＋＋－＋－＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－＋＋第21頁，本講稿共31頁（4）與類似菌鑒別本菌與其他類似菌的鑒別見表2。第22頁，本講稿共31頁

5.結(jié)果報告報告1g（mL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)量[個/g(mL)]。

第23頁，本講稿共31頁實驗三、食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗一、實驗?zāi)康?．學(xué)習(xí)蠟樣芽孢桿菌檢驗的原理和方法。2．了解蠟樣芽孢桿菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性。第24頁，本講稿共31頁蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種食品中檢出。蠟樣芽孢桿菌能發(fā)酵麥芽糖、蔗糖和水楊苷，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和側(cè)金盞花醇,卵磷脂酶和酪蛋白酶，過氧化氫酶試驗陽性，溶血，能在24h內(nèi)液化明膠和還原硝酸鹽，在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。二、實驗原理第25頁，本講稿共31頁三、實驗方法與步驟1．蠟樣芽孢桿菌檢驗程序

第26頁，本講稿共31頁2．菌數(shù)測定以無菌操作將檢樣25g或25ml按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1～10-5的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用L形棒涂布于整個表面，置37℃培養(yǎng)12～20h后，選取菌落數(shù)在30個左右者進行計數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。計數(shù)后，從中挑取5個這樣的菌落作證實試驗。根據(jù)試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該培養(yǎng)皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。第27頁，本講稿共31頁將檢樣或其稀釋液劃線于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置37℃培養(yǎng)12～20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然后做證實試驗。3．分離培養(yǎng)第28頁，本講稿共31頁（1）形態(tài)觀察本菌應(yīng)為G＋桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一