鏈尿佐菌素高熱糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型的建立

鏈尿佐菌素高熱糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型的建立

2型糖尿?。ɑ儯┦侵敢砸葝u素分泌缺陷和胰島素抵抗為主要病理依據(jù)和特征，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂的糖尿病，與1型糖尿病的內(nèi)在機(jī)制存在顯著差異。科研上的糖尿病動(dòng)物模型通常分為遺傳自發(fā)和人工誘發(fā)2類,遺傳自發(fā)糖尿病動(dòng)物模型,如BB鼠、NOD鼠、db/db鼠、NYS鼠等,來源困難且價(jià)格昂貴,所以用得較少;人工誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型最簡便、最價(jià)廉的方法是通過給大鼠注射化學(xué)藥物,如鏈尿佐菌素(streptozotocin,STZ)或四氧嘧啶(alloxan),選擇性破壞胰島β細(xì)胞,引起細(xì)胞壞死,導(dǎo)致血胰島素不同程度下降和血糖升高,但形成的是1型糖尿病動(dòng)物模型。然而,給大鼠飼喂足夠時(shí)間的高糖高脂飲食,雖不至于引起血糖水平明顯上升,卻可造成廣泛的胰島素抵抗,本實(shí)驗(yàn)為滿足有關(guān)研究需要,將以上兩者有機(jī)結(jié)合,成功復(fù)制出2型糖尿病動(dòng)物模型,報(bào)告如下。1材料和方法1.1飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)時(shí)間選擇健康的雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量120~160g(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部提供),飼養(yǎng)在室溫18~25℃,相對濕度50%~80%的環(huán)境條件下,每籠5只,共分6籠,自由采食、飲水。1.2血糖、胰島素放免試劑UV-754型分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);TD4-臺式離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠);GOD-PAP血糖檢測試劑盒、胰島素放免試劑盒(北京福瑞生物工程公司);胰島素(美國Lilly公司)。1.3方法1.3.1高糖高脂飼料的組成大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,逐一稱重,隨機(jī)分成2組,實(shí)驗(yàn)組20只,對照組10只。實(shí)驗(yàn)組飼喂高糖高脂飼料,高糖高脂飼料的組成:基礎(chǔ)料66.6%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%,將這些成分加適量水拌勻揉團(tuán)做成條狀,然后放在恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)80~85℃干烤3~4h;對照組飼喂基礎(chǔ)顆粒飼料。1.3.2血糖及血清胰島素檢測實(shí)驗(yàn)組飼喂高糖高脂、對照組飼喂基礎(chǔ)飼料達(dá)3周時(shí),全部大鼠斷料不斷水12h后剪尾采血1mL,以2000r/min離心20~30min,吸出血清0.4mL分別用于測血糖及血清胰島素。采血后即給實(shí)驗(yàn)組大鼠1次性腹腔注射STZ25mg/(kg·BW)(STZ溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,所配濃度為10g/L);腹腔注射STZ后的第2、4周時(shí)行第2、3次采血,以血糖值≥16.7mmol/L為達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn),采血方法及檢測指標(biāo)與第1次相同。對照組腹腔注射相應(yīng)容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,3次采血方法同實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組又分為2小組:第1次采血的血液指標(biāo)檢測值為高糖高脂組;腹腔注射STZ后第2、3次采血檢測達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)大鼠的血液指標(biāo)值為糖尿病組。1.3.3續(xù)剪尾采血單次采血實(shí)驗(yàn)組腹腔注射STZ后的第3天,全部大鼠斷料不斷水12h后連續(xù)剪尾采血3次,每次采血100μL左右,用于測血糖、做糖耐量實(shí)驗(yàn)。第1次采血后即以20%葡萄糖灌胃[劑量2g/(kg·BW)],灌胃后依次后推1h進(jìn)行第2次、再后推1h進(jìn)行第3次采血。1.3.4其他血糖測定用比色法,即GOD-PAP法;血清胰島素測定用放免法。1.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用方差分析及q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1糖的抗劑試驗(yàn)糖耐量實(shí)驗(yàn)的3次取血均顯示實(shí)驗(yàn)組血糖明顯高于對照組,這表明實(shí)驗(yàn)組注射STZ后的空腹血糖增高和糖耐量明顯降低(表1)。2.2成模前后大鼠的島素變化高糖高脂組空腹血糖與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但血清胰島素高于對照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)組成模狀況:有25只大鼠造模成功,空腹血糖及血清胰島素與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。成模后的大鼠并出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿、消瘦;實(shí)驗(yàn)組有3只、對照組有1只大鼠死亡。3周血糖高、大鼠輸注時(shí)造成1型糖尿病,2一直以來,人工誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型多采用注射STZ的方式,STZ對胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用,進(jìn)而引發(fā)實(shí)驗(yàn)性糖尿病。然而,單純以這種方式所誘發(fā)的模型只符合1型糖尿病特征,與2型糖尿病的病理特征和臨床特點(diǎn)相差較大。有研究表明,高脂飼料喂養(yǎng)可以引起大鼠廣泛的胰島素抵抗,雖不致于使血糖明顯的升高,卻可以在同時(shí)進(jìn)行小劑量注射STZ造成的胰島β細(xì)胞輕度損傷的情況下,使多數(shù)動(dòng)物產(chǎn)生糖耐量異常,再喂以高糖飼料引起動(dòng)物肥胖,也可以復(fù)制出2型糖尿病的大鼠模型,本實(shí)驗(yàn)是依據(jù)這種理論來設(shè)計(jì)的。本實(shí)驗(yàn)給實(shí)驗(yàn)組大鼠注射STZ后第3天的糖耐量實(shí)驗(yàn)即顯示出糖耐量異常,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),這表明實(shí)驗(yàn)組注射STZ后對胰島β細(xì)胞的破壞作用。本實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組大鼠并不是在幾天內(nèi)全部被復(fù)制成標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病模型,而是通過注射STZ后的第2、4周時(shí)的取血檢測表明逐步全部成為糖尿病模型的。據(jù)董佳生、沈亞非等對1型糖尿病動(dòng)物模型的復(fù)制實(shí)驗(yàn)報(bào)道,實(shí)驗(yàn)組大鼠在一次性大劑量注射STZ60mg/(kg·BW)后的第3天,血糖均達(dá)≥16.7mmol/L的造模標(biāo)準(zhǔn),且4周內(nèi)均維持標(biāo)準(zhǔn)水平,即注射后的第3天,1、2、3、4周血糖值,對照組依次為(3.89±0.36、3.80±0.39、3.77±0.46、3.96±0.33、3.89±0.46)mmol/L,實(shí)驗(yàn)組依次為(21.42±6.87、21.74±6.58、21.07±6.67、21.54±6.19、21.20±6.41)mmol/L,均顯著高于對照組(P<0.01)。這可能是由于一次性注射STZ的量不同而致的差別。有研究表明,STZ致胰島細(xì)胞損傷程度取決于注射劑量,低劑量誘導(dǎo)β細(xì)胞INS-1凋亡,高劑量致β細(xì)胞壞死。本實(shí)驗(yàn)所注射的STZ相對較少,因而對胰島β細(xì)胞的損傷相對較輕,大鼠成模的速度則較緩些,然而,大劑量的一次性注射STZ,會致大量的胰島β細(xì)胞被破壞,可能會使造模動(dòng)物的存活率降低,而本實(shí)驗(yàn)小劑量注射STZ,成模動(dòng)物的存活率相對較高,模型動(dòng)物的生命力相對較強(qiáng),有利于進(jìn)行糖尿病的其他相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)STZ注射劑量,系經(jīng)查有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比較并經(jīng)預(yù)試而作出的選擇,有些較新的文獻(xiàn)所報(bào)道的復(fù)制1型糖尿病大鼠ZTS的注射劑量為60mg/(kg·BW),顯然對于本實(shí)驗(yàn)不合適,但他們所檢測到的數(shù)據(jù)可以為本實(shí)驗(yàn)提供參考,亦即按60mg/(kg·BW)劑量注射后,大鼠血糖在大幅升高的同時(shí)其血清胰島素亦極顯著的降低,造成典型的1型糖尿病;一些文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)制2型糖尿病大鼠STZ的注射劑量可為30mg/(kg·BW),然而與所報(bào)道的結(jié)果特征不太一致。另有文獻(xiàn)報(bào)道,復(fù)制2型糖尿病大鼠STZ的注射劑量為25mg/(kg·BW),其結(jié)果的重復(fù)性也較好,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)前的預(yù)試,證實(shí)該劑量比較合適。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,完全合符2型糖尿病的建模要求,即大鼠經(jīng)高糖高脂飼料飼養(yǎng)后,小劑量的一次性注射STZ,可造成大鼠的糖耐量異常卻仍然可保持大鼠經(jīng)高糖高脂飼料飼喂以后的高胰島素血癥。在本研究中,實(shí)驗(yàn)組在未注射STZ前取血所檢測的指標(biāo)值(即高糖高脂組)顯示血糖與對照組相比沒有升高,而血清胰島素極顯著的高于對照組,這種現(xiàn)象與有關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道的結(jié)論極為一致。而從糖尿病組大鼠的血液檢測指標(biāo)值來看,血糖極顯著的升高,血清胰島素雖顯著的高于對照組,但與高糖高脂組