夏季藍(lán)藻蛋白提取方法比較研究

夏季藍(lán)藻蛋白提取方法比較研究

藍(lán)藻是一個非常古老、非常小的原核生物，具有很強(qiáng)的生態(tài)競爭優(yōu)勢。隨著營養(yǎng)化，藍(lán)藻成功地生長和繁殖，形成水體，給水體帶來嚴(yán)重的污染。海藻蛋白（pc）位于620nm附近的海域。它是藍(lán)藻的特征色素蛋之一。在監(jiān)測環(huán)境中，尤其是在經(jīng)常發(fā)生爭議的水域，海藻蛋白的濃度可以有效地代表藻類的生物量。正確提取水中的海藻藍(lán)蛋，對檢測海藻藍(lán)蛋濃度和藍(lán)藻水華具有重要意義。目前,實驗使用的藻藍(lán)蛋白的提取方法較多,常用的有反復(fù)凍融法、化學(xué)試劑處理法、溶脹法、超聲波法等[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21].典型研究如Padgett等使用反復(fù)凍融法提取了銅綠微囊藻中的藻藍(lán)蛋白;曲文娟等采用脈沖超聲輔助技術(shù)提取鈍頂螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白;朱麗萍等以溶脹法提取多管藻中的藻藍(lán)蛋白.但是,不同研究側(cè)重點(diǎn)不同,基于藻種不同,得到的結(jié)論存在差異.對于藻藍(lán)蛋白提取效果的評價,上述研究也主要基于提取液的藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果進(jìn)行,較少做吸收光譜方面的分析研究,而吸收光譜是藻藍(lán)蛋白濃度定量的基礎(chǔ).此外,已有的藻藍(lán)蛋白提取研究多側(cè)重于實驗室內(nèi)培養(yǎng)的藻類.太湖是富營養(yǎng)化嚴(yán)重的渾濁水體,湖泊中藻種多樣,藻種結(jié)構(gòu)也具有明顯的時空差異.因此,在使用上述方法提取太湖水體中的藻藍(lán)蛋白時需要做具體分析.本文以2011年8月20日采集的太湖梅梁灣藍(lán)藻水華樣品為研究對象,選取反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取水樣中的藻藍(lán)蛋白.基于光譜吸收特征和藻藍(lán)蛋白濃度統(tǒng)計結(jié)果對各種提取方法進(jìn)行評價,以期為太湖藍(lán)藻水華的監(jiān)測提供基礎(chǔ)支撐.1材料和方法1.1藻藍(lán)蛋白pla水樣采自太湖梅梁灣湖區(qū)表層30cm水體,共12個樣點(diǎn)(圖1).采集日期為2011年8月20日.采樣期間天氣晴朗,風(fēng)速為0.8~2.2m/s.水樣采集后放入冷藏箱內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行分析.藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品購自美國Sigma公司,編號為P6161.1.2樣品采集和水樣采集將野外采集的太湖水華溶液混勻,每種藻藍(lán)蛋白的提取方法分別平行采集相同體積的太湖樣品,采用1.2μm孔徑的WhatmanGF/C濾膜真空泵抽濾,不同樣點(diǎn)采集的水樣水質(zhì)狀況不同,過濾體積稍有差異.以1#~12#表示各樣點(diǎn)水樣.1.3供試儀器與方法分別參照下述方法提取1#~12#太湖藍(lán)藻水樣中的藻藍(lán)蛋白.每種提取方法設(shè)置3個平行樣.反復(fù)凍融法:將附著藻體的濾膜放入凍存管中,同時加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液于-20℃冰箱冷凍,然后室溫避光解凍,如此反復(fù)凍融7次.解凍的樣品以12000轉(zhuǎn)/min離心10min,取離心后的上清液作為待測液.超聲波法:將附著藻體的濾膜置于超聲波儀中,以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為溶媒,超聲波處理20min(功率800W).超聲波處理結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10min,取離心后的上清液作為待測液.溶脹法:將附著藻體的濾膜放入燒杯中,同時加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,在15℃的條件下溶脹提取,溶脹時間為3d.提取結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10min,取離心后的上清液作為待測液.丙酮法:將附著藻體的濾膜放入試管中,同時加入90%的丙酮抽提脂溶性色素,以12000轉(zhuǎn)/min離心10min.取上清液作為丙酮法的對比待測液,同時將剩余的藍(lán)色沉淀加一定量0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,置于磁力振蕩攪拌器上高速攪拌20min,再以12000轉(zhuǎn)/min離心10min,取離心后的上清液作為丙酮法的待測液.1.4藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制使用0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液,配置濃度為20、10、7、5、4、2、1和0.5mol/L的藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品系列,使用P1至P8表示.1.5藻藍(lán)蛋白濃度cpc的測定使用島津UV-2450/UV-2550分光光度計測量各待測液和標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度.分光光度計掃描波長為350~750nm,分辨率為1nm.根據(jù)Bennett等的公式求取藻藍(lán)蛋白濃度:式中,藻藍(lán)蛋白濃度CPC的單位為mg/ml;A615、A652分別是藻藍(lán)蛋白在615、652nm處的吸光度.1.6處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析在SPSS16.0軟件中進(jìn)行.2結(jié)果與分析2.1藻藍(lán)蛋白提取液的光譜特征反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取的各樣品的藻藍(lán)蛋白吸收光譜如圖2,圖中各樣品的吸光度值以其平行樣的吸光度均值表示.在350~750nm的測量波長范圍內(nèi),丙酮法藻藍(lán)蛋白提取液(圖2d)的吸收光譜形狀和吸收峰的位置與標(biāo)準(zhǔn)樣品(圖2f)一致.對比測量的丙酮上清液(圖2e)在波長430、480、620和670nm處均具有吸收峰,且430、480和670nm處吸收峰的峰高比620nm強(qiáng).反復(fù)凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)的藻藍(lán)蛋白提取液在620nm附近出現(xiàn)主吸收峰,其中,反復(fù)凍融法620nm的峰高最強(qiáng),超聲波法最弱.此外,反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670nm附近還具有次吸收峰,其位于650~700nm區(qū)間的譜型特征與標(biāo)準(zhǔn)樣品存在差異.2.2反復(fù)凍融法與超聲法提取的藻藍(lán)蛋白的差異性以Bennett等的公式計算各提取方法對應(yīng)的1#~12#水樣的藻藍(lán)蛋白濃度值.由于不同點(diǎn)位的水質(zhì)狀況不同,水樣的平行樣的藻藍(lán)蛋白濃度均值具有差異.因而,文中使用變異系數(shù)(樣品平行樣的濃度值標(biāo)準(zhǔn)差與均值的比值)衡量不同方法提取的藻藍(lán)蛋白的差異性.變異系數(shù)如表1,平行樣的均值結(jié)果見圖3.反復(fù)凍融法、超聲波法不同水樣各個平行樣的變異系數(shù)均低于0.6(表1),表明這兩種方法平行樣的結(jié)果具有較好的一致性,測量操作誤差較小.由不同方法提取的藻藍(lán)蛋白濃度比較結(jié)果(圖3)可知,反復(fù)凍融法提取的1#~12#太湖水樣的濃度值均高于其他3種方法,溶脹法次之,超聲波法的提取效果最不理想.3種方法提取藻藍(lán)蛋白的吸收光譜和含量測定每種物質(zhì)都有自身的特征吸收光譜,吸收峰波長可以對已知物質(zhì)定性.已有研究結(jié)果[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]表明,藻藍(lán)蛋白吸收峰位于620nm附近.本文中反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的藻藍(lán)蛋白提取液在620nm附近具有吸收峰,反復(fù)凍融法620nm的峰高最強(qiáng),超聲波法最弱.這說明4種方法均能不同程度地提取出太湖藍(lán)藻水華樣品中的藻藍(lán)蛋白,其中,反復(fù)凍融法的提取效果優(yōu)于其他方法.反復(fù)凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670nm附近還具有吸收作用,650~700nm區(qū)間的譜型特征與標(biāo)準(zhǔn)樣品(圖2f)存在差異.這主要是由于反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的藻藍(lán)蛋白提取液均為粗提液,提取液中除了藻藍(lán)蛋白組分,還可能含有葉綠素蛋白復(fù)合體、別藻藍(lán)蛋白、細(xì)胞碎片等物質(zhì)組分.這些物質(zhì)組分的存在會使得藻藍(lán)蛋白提取液的吸收光譜特征發(fā)生改變.余九九等的研究結(jié)果表明,在以液氮凍融、超聲波破碎、蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶4種方法提取出極大螺旋藻藻泥、藻粉中的藻藍(lán)蛋白的同時,鑲嵌于類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體也會隨之脫落共存于提取液中,并對其670nm附近的吸收光譜特性產(chǎn)生影響.本文中反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670nm附近出現(xiàn)吸收峰,說明用這3種方法提取太湖藍(lán)藻水華樣品中的藻藍(lán)蛋白時受到了葉綠素蛋白復(fù)合體的影響.此外,與反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法,以及余九九等研究中的蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶等方法不同,丙酮法先以丙酮作為浸提溶劑破壞藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu).丙酮為有機(jī)溶劑,能使脂溶性的葉綠素a從復(fù)合體上脫落下來且以色素的形式溶于其中.故而,在丙酮上清液棄除、磷酸鹽緩沖液再懸浮后獲取的藻藍(lán)蛋白提取液的吸收光譜上,未出現(xiàn)葉綠素蛋白復(fù)合體位于670nm附近的吸收峰(圖2d).以往的研究已證實了超聲波法能有效地破碎藻類細(xì)胞,提取出樣品中的藻藍(lán)蛋白.但是本實驗中,無論是從圖譜分析還是計算濃度值的統(tǒng)計結(jié)果來看,超聲波法的提取效果均不理想,提取不完全現(xiàn)象嚴(yán)重.究其原因,主要受研究對象的影響.與室內(nèi)培養(yǎng)的純藻種樣品不同,野外采集太湖水樣中的藻體多以包裹體形式存在.包裹體表面附有群體膠鞘,破壁所需的超聲強(qiáng)度較室內(nèi)藻種大.此外,朱麗萍等和尹興娟等的研究表明,藻藍(lán)蛋白熱穩(wěn)定性差,在40℃即發(fā)生變性.增加超聲波作用的強(qiáng)度和延長作用的時間均會導(dǎo)致熱效應(yīng)增加,使得細(xì)胞內(nèi)蛋白等有效組分的破壞.因此,在太湖藍(lán)藻水樣的藻藍(lán)蛋白提取中,單純用超聲波來破碎藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)是不夠的.相較于超聲波法,溶脹法在620nm藻藍(lán)蛋白特征峰處的峰值和相應(yīng)的計算濃度值均有所提高,但其提取率仍低于反復(fù)凍融法.譚嘯等的研究表明太湖水體中藻種眾多,藻種結(jié)構(gòu)具有明顯的時空差異.余九九等、韋萍等的研究證實不同藻種所需溶脹溶劑不同.因此,多藻種共存可能是溶脹法提取效果不理想的一個影響因素.從吸收光譜圖(圖2)來看,溶脹法在350~500nm光譜區(qū)間的吸光度值衰減率高于其他方法.溶脹法提取周期長,提取過程中藻體一直與液態(tài)溶劑接觸,導(dǎo)致藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎,產(chǎn)生的降解物增多,這可能是產(chǎn)生該差異的一個重要原因.此外,大量有機(jī)降解物的產(chǎn)生也會改變?nèi)芤旱膒H環(huán)境,使得藻藍(lán)蛋白活性降低,反而不利于藻藍(lán)蛋白的提取.丙酮法的藻藍(lán)蛋白提取液在670nm附近未出現(xiàn)葉綠素蛋白復(fù)合體的吸收峰,但其在620nm處的峰高低于反復(fù)凍融法和溶脹法.尹興娟等的研究表明,藻藍(lán)蛋白由載體蛋白和藻藍(lán)素(發(fā)色團(tuán))組成.細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎后溶出的水溶性藻藍(lán)蛋白可溶于氯仿等有機(jī)溶劑中,變?yōu)橹苄缘脑逅{(lán)素.實驗中使用的丙酮為有機(jī)溶劑,能使脂溶性的色素溶于其中.因此,本文同時測量了丙酮法提取的丙酮上清液(圖2e)和再溶解后的藍(lán)色沉淀部分(圖2d),并對其吸收光譜和濃度結(jié)果進(jìn)行了比較.吸收光譜圖中(圖2),兩種待測液均在620nm附近出現(xiàn)吸收峰,且二者的吸收峰強(qiáng)度相當(dāng),說明丙酮法能提取出樣品中的部分藻藍(lán)蛋白,亦說明丙酮方法提取出的藻藍(lán)蛋白會以藻藍(lán)素的形式溶于丙酮而存在不同程度的損失.濃度統(tǒng)計結(jié)果(圖3)中丙酮法提取的藻藍(lán)蛋白濃度值小于反復(fù)凍融法和溶脹法也證明了這一點(diǎn).此外,在丙酮法提取中,上清液和藍(lán)色沉淀的分離存在不確定性,藍(lán)色沉淀部分再溶解也存在不完全現(xiàn)象,均會對其提取測量的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響.吸收光譜的圖譜分析結(jié)果(圖2)和藻藍(lán)蛋白濃度計算結(jié)果(圖3)均表明,反復(fù)凍融法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法.反復(fù)凍融法主要通過細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和剩余細(xì)胞液鹽濃度的增高引起溶脹,使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破碎,藻膽體內(nèi)的藻藍(lán)蛋白溶出.李冰等的研究指出,藻藍(lán)蛋白在低溫狀態(tài)下具有較好地穩(wěn)定性.因此,當(dāng)樣品中存在包裹體且藻類組成不同時,可以通過增加反復(fù)凍融次數(shù)和降低凍融溫度的方式來提高提取率.此外,藻體在反復(fù)凍融提取的大部分時間里均處于結(jié)凍狀態(tài),細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎降解產(chǎn)生有機(jī)質(zhì)的含量較溶脹法小,pH環(huán)境穩(wěn)定,易于保持藻藍(lán)蛋白的活性.但是,與超聲波法、溶脹法類似,在細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎藻藍(lán)蛋白溶出的同時,位于類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體也同時釋放出來.從吸收光譜圖(圖2)來看,葉綠素蛋白復(fù)合體位于670nm附近的吸收峰對650nm處的吸光