酵母雙雜交系統(tǒng)的研究與應(yīng)用

酵母雙雜交系統(tǒng)的研究與應(yīng)用

母親和兒子的雙雜交系統(tǒng)（簡稱雙無序系統(tǒng)），也被稱為相互作用鉤子系統(tǒng)。1989年，該系統(tǒng)由字段s和歌曲引入，并首次建立。這一系統(tǒng)是在釀酒酵母中研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種非常有效的分子生物學(xué)方法。上個世紀(jì)90年代初期發(fā)展成為一種靈敏的真核細(xì)胞內(nèi)鑒定基因的方法，可有效地用來分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。此技術(shù)以其簡便、靈敏、高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。迄今為止，在雙雜交體系的基礎(chǔ)上已發(fā)展了很多相關(guān)技術(shù)，人們應(yīng)用雙雜交體系及相關(guān)技術(shù)已取得了很多科研成果。本文介紹這一技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用和前景。1轉(zhuǎn)錄活性成分酵母雙雜交系統(tǒng)最初是根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)建立的。真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個相對獨(dú)立的功能區(qū)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD)。前者負(fù)責(zé)識別結(jié)合上游順式激活序列(upstreamactivationsequence,UAS如GAL4UAS)，后者則與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的其它成分相互作用，啟動所調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。BD與AD可以人為地分離，分離的DNA-BD和AD單獨(dú)分別作用，并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上較為接近時，則呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性。將DNA-BD序列與一已知的蛋白質(zhì)X(常稱為誘餌，bait)的基因結(jié)合，構(gòu)建出BD-X融合表達(dá)載體；將AD序列與擬研究的另一蛋白Y——靶蛋白(target或prey)的基因結(jié)合，構(gòu)建出AD-Y表達(dá)載體(圖1-a)。將這兩個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，此種酵母菌株即含有特定報道基因(如LacZ、His3等)，并且已是去掉相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，因此本身無報道基因的轉(zhuǎn)錄活性。如果蛋白質(zhì)X和Y可以相互作用，則即導(dǎo)致BD與AD在空間上的接近，從而激活UAS下游啟動子調(diào)節(jié)的報道基因的表達(dá)(圖1-b);反之，BD與AD就不能結(jié)合，報道基因也不能被啟動表達(dá)。因此,可以通過檢測報道基因表達(dá)與否來研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。如果將Y換成cDNA文庫，就可以從cDNA文庫中篩選與已知蛋白質(zhì)X相互作用的未知蛋白質(zhì)的編碼序列。2與ad融合的基因酵母雙雜交系統(tǒng)由3個部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。最常用的DNA-BD是GAL4和LEX蛋白的DNA-BD。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。最常用的AD是GAL4和HSVVP16的AD。(3)帶有一個或多個報道基因的宿主菌株。常用的報道基因有LacZ和營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記如His3等，前者可以方便地通過X-gal存在時的顏色反應(yīng)篩選陽性克隆，后者則根據(jù)篩選培養(yǎng)基上的生長與否判斷。目前常用的是選擇兩種或兩種以上的報道基因，因而使檢測更準(zhǔn)確和有效。而雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因，這很有利于實驗后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。3al4uas和報道基因his3如酵母菌Y190，其染色體上整合有GAL4上游順式激活序列(GAL4UAS)和報道基因His3。Y190同時還含有一質(zhì)粒，此種質(zhì)粒含有GAL4操縱基因和下游的LacZ基因。這樣Y190中就具備了同時受GAL4操縱基因調(diào)節(jié)的2個報道基因。3.2d質(zhì)粒的構(gòu)建將已知的誘餌蛋白編碼基因按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)克隆進(jìn)DNA-BD質(zhì)粒如pGBT9中(GAL4+Polylinker+Trp1+Ampr)，構(gòu)建成可表達(dá)GAL4-bait融合蛋白的質(zhì)粒pGAL4-bait，此融合蛋白即為雙雜交系統(tǒng)中的第一個雜交蛋白。3.3誘導(dǎo)蛋白的篩選和表達(dá)將pGAL4-bait轉(zhuǎn)化Y190，由于質(zhì)粒pGBT9含有Trp1基因，所以在缺Trp1的培養(yǎng)基上可以篩選到pGAL4-bait質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子。通過檢測His3和LacZ基因的表達(dá)活性，可鑒定誘餌蛋白的特性。若此蛋白本身具有轉(zhuǎn)錄激活活性，那它就不適宜做誘餌蛋白，需重新設(shè)計或修飾；反之，就可以繼續(xù)進(jìn)行下續(xù)步驟。3.5gal/his-trp-leu-+3-at要選擇gal/his-trp從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，并共轉(zhuǎn)化給感受態(tài)的釀酒酵母寄主菌株(如Y190)，再將此種共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布在Gal/His-Trp-Leu-+3-AT培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)藍(lán)色的則為陽性；如果是篩選文庫，篩選呈藍(lán)色的陽性菌落，并培養(yǎng)在僅缺Lue2的培養(yǎng)基中即可獲得只含靶蛋白或文庫基因的質(zhì)粒，提取其中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的DH5α,可獲得只含靶蛋白或文庫質(zhì)粒的DH5α，然后進(jìn)一步分離相應(yīng)的質(zhì)粒，并對其編碼未知蛋白的cDNA進(jìn)行序列分析，以期發(fā)現(xiàn)新基因。4植物研究中的應(yīng)用用酵母雙雜交體系研究植物主要集中于模式植物擬南芥，也偶有用于研究煙草、矮牽牛和菠菜的報道。4.1過濾cDNA文庫中編碼與誘餌蛋白特異作用的未知蛋白并用于研究這些蛋白質(zhì)的功能，這在植物研究中應(yīng)用最多，并涉及諸多方面。4.1.1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作為開花生理研究中的重要里程碑之一的是1960年證實光敏色素的存在。光敏色素是植物一種重要的光受體，參與植物發(fā)育的光形態(tài)建成已被確認(rèn)，但其在感受環(huán)境信息之后的進(jìn)一步功能，一直是以假說解釋的，研究也長期處于停滯狀態(tài)。后來，隨著雙雜交系統(tǒng)的完善，人們開始用此技術(shù)篩選克隆與光敏色素相互作用的蛋白質(zhì)。美國Quail實驗室的Ni等首先以光敏色素C末端序列為誘餌，從擬南芥的cDNA文庫中篩選到一個與光敏色素發(fā)生相互作用的蛋白PIF3，是一個轉(zhuǎn)錄因子。馬力耕和孫大業(yè)也克隆到一種體內(nèi)與光敏色素相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，并證實被光活化的光敏色素可直接進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動基因表達(dá)。Fankhauser等和Choi等用同樣的方法，分別檢測到另外2種與光敏色素相互作用的蛋白：PSK1和NDPK2。Quail用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與光敏色素家族成員相互作用的成分。根據(jù)對此種成分的分析，他們提出了新的細(xì)胞內(nèi)信號可能的傳遞途徑。近年來，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展以及這些技術(shù)在植物發(fā)育過程中的廣泛應(yīng)用，越來越多控制發(fā)育的基因，尤其是控制花器官形成的基因相繼得到克隆。其中很大一部分是含MADS-box的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。研究這些基因的生物學(xué)功能，如何對它們進(jìn)行調(diào)控，勢必需對與其相互作用的因子進(jìn)行鑒定，而酵母雙雜交系統(tǒng)則可以方便地解決這一問題。Fearon等用此種技術(shù)證實擬南芥花發(fā)育期間的器官特異性因子AGAMOUS與一特異蛋白質(zhì)相互作用，后者富含重復(fù)亮氨酸序列。這是首次證實植物中MADS-box的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與非MADS-box蛋白之間發(fā)生作用?；ǚ坌纬?、花粉管萌發(fā)及其伸長生長機(jī)制也是近年來的研究熱點(diǎn)。PRK1是矮牽牛花粉中特異表達(dá)的一種受體類似物(receptor-like)激酶。此種蛋白是有絲分裂后配子體發(fā)育和胚囊形成所必需的，但是有關(guān)PRK1在此途徑中的分子作用機(jī)制還知之甚少。Seong用PRK1的激酶區(qū)域作誘餌篩選與PRK1相互作用的蛋白時，得到一cDNA克隆，其編碼的蛋白與人和酵母的翻譯起始因子eIF2B中的β亞基有很高的同源性。這暗示，在花粉發(fā)育過程中，由PRK1介導(dǎo)產(chǎn)生的信號，其所調(diào)節(jié)的基因表達(dá)在很大程度上是在翻譯水平上進(jìn)行的。P顆粒(granule)的形成是植物育性所必需的，而GLH蛋白是組成P顆粒的重要成分,Smith等用酵母雙雜交系統(tǒng)證實其與受粉必需蛋白CSN-5及KGB-1相關(guān)，還與細(xì)胞骨架蛋白ZYX-1有關(guān)。此外，戴良英等用酵母雙雜交系統(tǒng)研究了從擬南芥的茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中分離得到的第一個基因——CoI1基因的互作基因。Yamazaki等研究藻類植物Perillafrutescens的花青素生物合成途徑調(diào)節(jié)機(jī)制，并證實特異bHLH因子MYC-F3G1可與另一bHLH因子MYC-RP以及含WD40重復(fù)序列的蛋白PFWD相互作用，而與光誘導(dǎo)MYB因子MYB-P1則不發(fā)生作用。他們認(rèn)為MYC-F3G1、MYC-RP和PFWD的蛋白復(fù)合體對P.frutescens中花青素生物合成基因有調(diào)節(jié)作用。4.2同領(lǐng)域和不同實驗室中分離的基因隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和在研究植物生命過程中的廣泛應(yīng)用，越來越多的不同功能基因在不同領(lǐng)域和不同的實驗室中分離，如控制發(fā)育的多種基因、調(diào)節(jié)植物抗性的基因、參與植物感受外界因子的信號傳導(dǎo)相關(guān)基因等。這些基因在相關(guān)的生物學(xué)功能中的關(guān)系是直接的或是間接的，如何調(diào)控，在解決這些問題之前往往要確定它們之間是否相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)可以快速而方便地解決這一問題，并已在以下領(lǐng)域的研究中得到廣泛運(yùn)用。4.2.1與雙雜交活性劑的mapk1和dmpk4的相互作用在植物中，一些MAP激酶(MAPK)、MAPK激酶(MAPKK)和MAPKK激酶(MAPKKK)的同源物已有所報道，但在高等植物中這些激酶之間的相互作用和MAPK級聯(lián)的分子分析的報道還未見。Mizoguchi等用雙雜交技術(shù)證明ATMPK4(一種MAPK)、MEK1(一種MAPKK)和ATMEKK1(一種MAPKKK)可以相互作用，在擬南芥中形成一特殊的MAPK級聯(lián)。這是首次報道植物中可能有MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)級聯(lián)。Ichimura等以ATMEKK1為誘餌，用雙雜交系統(tǒng)篩選得到MAPKK同源物ATMKK2和MAPK的同源物ATMPK4,以及一未知蛋白。進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)ATMPK4與ATMEKK1的N末端的調(diào)節(jié)域相互作用，而ATMKK2/MEK1和ATMEKK1的C末端的激酶活性域相互作用，由此認(rèn)為這3種蛋白有可能在體內(nèi)形成復(fù)合物。4.2.2．雙雜交技術(shù)植物發(fā)育調(diào)控基因的研究一直是植物科學(xué)中的研究熱點(diǎn)，運(yùn)用不同的分子生物學(xué)手段和遺傳方法，越來越多的基因得到分離，雙雜交技術(shù)可以用于研究這些基因在生物功能上的相關(guān)性。目前這方面的應(yīng)用還不是太多。Spillane等在研究擬南芥生殖發(fā)育時期調(diào)控細(xì)胞增殖的polycombgroup蛋白FIE基因家族中，發(fā)現(xiàn)其與MEA(編碼動物Pc-G蛋白基因的同源基因)產(chǎn)物可以相互作用。4.2.3葉綠體atp合酶亞基間相互作用植物的很多生物學(xué)功能是由一系列蛋白質(zhì)復(fù)合體執(zhí)行的，最典型的例子就是執(zhí)行能量轉(zhuǎn)換的光合作用的運(yùn)行，如光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換是由在類囊體膜上具有一定分子排列方式及空間構(gòu)象的膜脂蛋白復(fù)合體完成的。其中催化ATP合成的ATP合酶(又稱光合磷酸化反應(yīng)耦聯(lián)因子)具有CF0和CF1兩個部分共9種亞基，每種亞基均行使其特有功能。研究高等植物ATP合酶各亞基間的相互作用對完善結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)酶的功能有重要意義。石曉冰等用雙雜交系統(tǒng)檢測菠菜葉綠體ATP合成酶CF1各亞基(αβγεδ)間相互作用的結(jié)果表明：α與β、α與ε、β與δ亞基間有穩(wěn)定的相互作用；γ和ε的相互作用較強(qiáng)；γ與δ、δ與ε間有微弱的或短暫的相互作用；α與γ、α與δ、β與γ等亞基在酵母系統(tǒng)中無相互作用。由此,他們認(rèn)為高等植物葉綠體CF1δ亞基的高級結(jié)構(gòu)，以及δ亞基在ATP合酶上的空間位置可能與細(xì)菌ATP合酶有所不同。此外，他們還檢測了葉綠體ATP合酶CF1與CF0亞基間的相互作用。這些結(jié)果有助于研究ATP合酶在催化過程中的結(jié)構(gòu)變化和亞基間的相互關(guān)系。5發(fā)酵調(diào)節(jié)因子酵母雙雜交技術(shù)創(chuàng)立至今的十幾年中，在基因和蛋白質(zhì)研究中已得到廣泛應(yīng)用，并取得了許多有價值的結(jié)果。除了在酵母中應(yīng)用外，此項技術(shù)已擴(kuò)展到哺乳動物和植物細(xì)胞的研究中。用酵母雙雜交技術(shù)鑒定的多種受體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、磷酸化酶、腫瘤發(fā)生蛋白、細(xì)胞骨架蛋白以及參與細(xì)胞周期調(diào)控的因子不勝枚舉。但從總體來說，此項技術(shù)在免疫、細(xì)胞、動物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用明顯多于植物，國內(nèi)在這方面的研究尤為欠缺。迄今,人們對植物生長、發(fā)育和植物的一系列生理過程及機(jī)制，還有許多問題不很清楚，如花形態(tài)建成中的基因控制、營養(yǎng)生長的基因控制、生化代謝合成的基因調(diào)控等。盡管目前已經(jīng)建立了各種克隆新基因的技術(shù)，克隆了許多與植物生長發(fā)育過程相關(guān)的基因，但酵母雙雜交技術(shù)無疑會推動這些問題的研究。這一技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是只需對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境蛋白——蛋白之間的相互作用進(jìn)行分析，不必像傳統(tǒng)生化方法那樣花費(fèi)大量精力去純化蛋白。相信今后借助此種系統(tǒng)，可以圓滿而有成效地解決植物生命活動中的許多難題?，F(xiàn)在已有幾種改進(jìn)的酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序大同小異，這里只介紹比較通用的一種。3.1基于pgad424或pact的生物基因文庫將有可能與誘餌蛋白相互作用的另一蛋白質(zhì)的編碼基因克隆到AD-質(zhì)粒如pGAD424或pACTⅡ中，如果是篩選未知蛋白，則把cDNA片段克隆在pGAD424或其他質(zhì)粒載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。此種質(zhì)粒含Lue2基因，可在缺Lue2的培養(yǎng)基上得到陽性轉(zhuǎn)化子。此質(zhì)?？杀磉_(dá)第二個雜交蛋白。3.4單素物質(zhì)的構(gòu)建4.1.2cdk基因表達(dá)對材料活性的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育是以細(xì)胞的分裂、生長和分化為基礎(chǔ)的，因此在細(xì)胞水平上研究植物的發(fā)育必然要涉及到細(xì)胞周期的調(diào)控。近年研究得知，控制細(xì)胞周期的關(guān)鍵酶是一種依賴于細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinase,CDK)，因此研究植物發(fā)育過程中CDK活性的調(diào)節(jié)遂非?；钴S。Doonan和Forbert用雙雜交技術(shù)分離了CDK的相互作用蛋白，如cdk抑制子和suc1的同源物。Zhou等研究植物CDK抑制因子ICK與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子間相互作用的結(jié)果，證實可能存在A組和B組兩組CDK抑制因子，與這兩組抑制因子相互作用的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子并不一樣。人們已經(jīng)知道，E2F是調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄因子，一些植物中的E2F同源基因也已相繼得到克隆。Ramirez-Parra和Gutierrez等以E2F作“誘餌”，采用酵母雙雜交技術(shù)在小麥中分離到一種編碼小麥DP蛋白的cDNA克隆。Sekine等在煙草中也證明NtE2F與煙草Rb(retinoblastoma)相關(guān)蛋白是相互作用的。4.1.3雙雜交系統(tǒng)的研究蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞間以及細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制之一，在原核細(xì)胞和動物細(xì)胞中已廣泛進(jìn)行了研究。但在植物細(xì)胞中研究的起步相對較晚。上個世紀(jì)90年代以來人們在研究植物激素作用的分子機(jī)制中，逐步發(fā)現(xiàn)許多與動物細(xì)胞及原核細(xì)胞中磷酸化途徑同源的基因，如乙烯受體ETR1和細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的CKI1都是組氨酸激酶。但是這些基因的功能如何、在其作用過程中還有哪些因素參與都是有待解決的問題。雙雜交系統(tǒng)的完善是對這方面研究的極大推進(jìn)。Yamada等在研究組氨酸到天冬氨酸的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑時，發(fā)現(xiàn)一擬南芥的AtDBP(ArabidopsisthalianaDNA-bindingprotein)蛋白可以與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的ARR4反應(yīng)調(diào)節(jié)因子相互作用。Urao等從擬南芥中克隆到這一途徑中的1個組氨酸激酶(ATHK1)、3個磷酸化中間產(chǎn)物(ATHP1～3)和4個反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ATRR1～4)的編碼基因，并用酵母雙雜交技術(shù)檢測了它們之間的相互作用，初步查清了擬南芥中從組氨酸轉(zhuǎn)到天冬氨酸的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能路徑。同樣，Ichimura等對擬南芥的MAPK信號級聯(lián)系統(tǒng)也作了研究。他們以ATMEKK1為誘餌，篩選得到MAPKK同源物ATMKK2和MAPK的同源物ATMPK4以及一未知蛋白。ATMKK2和擬南芥中的MEK1(一種MAPKK)同源性很高。這些結(jié)果表明ATMEKK、ATMKK2/MEK1和ATMPK4有可能組成擬南芥中的MAPK級聯(lián)。4.1.4關(guān)于病原誘導(dǎo)下檢測相關(guān)基因的表達(dá)自從上個世紀(jì)40年代提出從遺傳上說明病原和寄主相互關(guān)