酵母gal4上轉(zhuǎn)錄活化因子的調(diào)控

酵母gal4上轉(zhuǎn)錄活化因子的調(diào)控

本超雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的生物方法。該系統(tǒng)于1989年提出。作為一種標(biāo)準(zhǔn)有效的蛋白質(zhì)分析工具，它已成為一個完整的分析蛋白質(zhì)和養(yǎng)分的工具，在最初的雙重母性中不斷得到改進(jìn)，為探討蛋白質(zhì)、養(yǎng)分和養(yǎng)分酸之間的相互作用提供了另一種選擇方法。1.發(fā)酵系統(tǒng)及分子活性的缺失真核生物中有一種特殊的上游激活順序(upstreamactivatingsequenceUAS),可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。它與激活蛋白結(jié)合大大增加啟動子的轉(zhuǎn)錄速度。GAL4蛋白上酵母的轉(zhuǎn)錄活化因子,有兩個結(jié)構(gòu)域,即氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)以及羧基端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivatingdomain,AD)。GAL4蛋白的這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有轉(zhuǎn)錄功能,但只有將這兩部分通過適當(dāng)?shù)耐緩竭B在一起后才能恢復(fù)激活轉(zhuǎn)錄的活性。根據(jù)這一特性,Fields等設(shè)計了一個系統(tǒng)即構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒,分別可以表達(dá)GAL4蛋白氨基端的1~147個氨基酸(BD)和羧基端的768~881個氨基酸(AD)。如果在BD上再接上一個蛋白X,又稱誘餌(bait),在AD上接上一個蛋白Y,又稱獵物(prey),再將這兩個質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌中,這樣,如果X、Y蛋白在酵母核內(nèi)發(fā)生交互作用,則相當(dāng)于將GAL4的BD和AD又連在一起,可以激活質(zhì)粒下游報道基因的表達(dá)。傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)具有一定的局限性。假陽性就是它的一個重要問題,由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母內(nèi)表達(dá)時的轉(zhuǎn)錄激活作用,使X-BD融合基因與Y-AD融合基因表達(dá)產(chǎn)物無需特異結(jié)合,就能啟動轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。另外有些蛋白質(zhì)表面有對其他蛋白質(zhì)的低親和力區(qū),容易形成蛋白體復(fù)合物,能夠引起報告基因表達(dá),使酵母出現(xiàn)相應(yīng)表型,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。另外,雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)無法進(jìn)行。還有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其它非酵母蛋白的輔助,這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。此外,外源蛋白過表達(dá)對酵母造成的毒性,以及蛋白質(zhì)錯誤折疊造成的功能喪失也是傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)中不容忽視的問題。2.母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展2.1“誘變”系統(tǒng)酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng)是在單個酵母細(xì)胞中引入兩個不同的BD來源的“誘餌”和一個共同AD的“獵物”,如果“誘餌”與“獵物”之間相互作用,則可激活“誘餌”特異性報告基因的表達(dá)。該系統(tǒng)的特點是僅在一個酵母細(xì)胞中就能同時進(jìn)行兩次獨立、瞬時的篩選,判斷一個“獵物”與兩個不同“誘餌”之間是否發(fā)生相互作用并進(jìn)一步比較其結(jié)合能力的差異,因而有效的提高篩選效率及靈敏度。該系統(tǒng)可以進(jìn)行靶蛋白突變位點的研究,也可以方便的比較靶蛋白與同一蛋白家族中不同成員之間相互作用的特異性。2.2雙雜交對酵母的調(diào)節(jié)作用逆向雙雜交系統(tǒng)與傳統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)的主要區(qū)別在于構(gòu)建一種反向篩選的報告基因,當(dāng)DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用時,就引起報道基因表達(dá),產(chǎn)生有毒性的報道蛋白,細(xì)胞不能生長。而BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。因此,利用逆向雙雜交系統(tǒng)對文庫進(jìn)行預(yù)清除,可大大減輕以后的假陽性鑒定工作。其最大的應(yīng)用前景是將它和組合化學(xué)一道進(jìn)行大規(guī)模、高通量小分子化合物或多肽藥物篩選。而且許多疾病與蛋白質(zhì)異常的相互作用相關(guān),發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)解離的物質(zhì)對疾病的治療是非常有意義的。2.3sos招授法檢測細(xì)胞的生長和代謝SOS招募系統(tǒng)最早是Aronheim等在1997年應(yīng)用的。Sos蛋白是人類的Ras通路中鳥苷酸交換因子(GEF),酵母中的GEF是Cdc25蛋白,與人類的Sos蛋白同源,其突變型Cdc25-2為溫度敏感型,在37℃不能生長。根據(jù)這個原理建立了Sos恢復(fù)系統(tǒng):將待研究的誘餌蛋白(X)的基因與Sos基因片段融合,將待篩選的cDNA文庫片段與膜定位信號肉豆蔻?；幕蚱稳诤?分別克隆到表達(dá)載體上,共轉(zhuǎn)化酵母溫度敏感缺陷株Cdc25-2。如果誘餌蛋白(X)可以與cDNA文庫的表達(dá)產(chǎn)物即獵物蛋白(Y)發(fā)生相互作用,就可以把Sos富集到細(xì)胞膜上,使得酵母細(xì)胞可以在限制溫度37℃生長;如果X不與Y發(fā)生相互作用,則Sos游離在細(xì)胞質(zhì)中,酵母細(xì)胞無法在37℃生長。SOS招募系統(tǒng)的主要優(yōu)點在于被研究的蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核中,因此在轉(zhuǎn)錄因子及胞質(zhì)中行使生理功能的蛋白質(zhì)的研究中可以得到廣泛的應(yīng)用。另外,一些原本對酵母生長有害的蛋白質(zhì)與Sos融合并在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)以后對酵母生長的毒性可能會降低。2.4采用rna聚合酶為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)是以轉(zhuǎn)錄因子Gal4為基礎(chǔ)的,依靠招募RNA聚合酶Ⅱ激活轉(zhuǎn)錄,有些轉(zhuǎn)錄激活蛋白不能用此系統(tǒng)分析。因此,1997年由Marsoliter等人發(fā)展了以RNA聚合酶Ⅲ為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng),激活聚合酶Ⅱ的組件并不能激活聚合酶Ⅲ起始的轉(zhuǎn)錄,它有更低的假陽性率。在此系統(tǒng)中,聚合酶Ⅲ反應(yīng)的報道基因SNR6的啟動子被修飾,其中包含一個Gal4結(jié)合位點,有利于Gal4融合的誘餌蛋白(X)結(jié)合于SNR6啟動子。獵物蛋白(Y)與TFⅢC因子的τ138亞單位融合。Gal4融合的誘餌蛋白(X)和τ138亞單位融合的獵物蛋白(Y)相互作用導(dǎo)致聚合酶Ⅲ反應(yīng)的SNR6報道基因的轉(zhuǎn)錄。2.5ad-y特征分析酵母單雜交系統(tǒng)與雙雜交系統(tǒng)不同之處在于,轉(zhuǎn)錄激活域AD相融合的獵物蛋白(Y)直接與DNA結(jié)合位點相結(jié)合,從而AD直接激活啟動子下游報告基因的表達(dá),無需BD-X的參與。因而通過對AD-Y文庫的篩選可分離出與靶DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)Y。該系統(tǒng)為轉(zhuǎn)錄因子的分離鑒定提供了有效的實驗手段。2.6蛋白x、y相互作用兩個蛋白之間通過第三者發(fā)生相互作用,第三物可以是蛋白質(zhì)、小分子或RNA。依賴于蛋白質(zhì)的三雜交系統(tǒng)有三種情況(1)兩個蛋白質(zhì)X和Y之間的接觸由于第三蛋白Z而穩(wěn)定和加強。(2)蛋白X和Y不直接接觸,而是通過另一蛋白Z相互作用,Z稱作橋蛋白。(3)第三種蛋白Z的表達(dá)使蛋白X、Y之間的相互作用更易于發(fā)生。通過小分子相互作用的三雜交系統(tǒng),小分子與其受體的相互作用不僅是許多生物學(xué)過程的基礎(chǔ),而且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的價值。通過RNA的三雜交系統(tǒng)確定識別目的RNA的蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合域,也可以研究被已知蛋白質(zhì)識別的RNA序列,利用這個系統(tǒng)成功地發(fā)現(xiàn)了許多RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用,而RNA與蛋白質(zhì)的相互作用又是某些生命的基礎(chǔ),如轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪切及RNA病毒與宿主之間的作用等。3.雙雜交分析中的假陰性現(xiàn)象隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的不斷改進(jìn),它的應(yīng)用領(lǐng)域也愈加廣泛,不僅用于檢測蛋白一蛋白的相互作用,還可以確定蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或重要活性位點、尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白、尋找調(diào)控蛋白相互作用的化合物、蛋白質(zhì)相互作用圖譜的繪制以及研究疾病的發(fā)生機制和藥物開發(fā)等方面。但是,雙雜交系統(tǒng)仍然存在有一些問題,如篩選到的有相互作用的兩個蛋白可能在體內(nèi)是表達(dá)在不同細(xì)胞,或是出現(xiàn)在細(xì)胞生長的不同周期,在細(xì)胞內(nèi)根本不能碰到,從而不可能發(fā)生相互作用。可能cDNA編碼的某個蛋白的一部分能和目標(biāo)蛋白起相互作用,而完整的蛋白則無法和目標(biāo)蛋白結(jié)合。篩到的蛋白和目標(biāo)蛋白的相互作用