序批式生物膜反應(yīng)器的細菌多樣性及其脫氮效果

序批式生物膜反應(yīng)器的細菌多樣性及其脫氮效果

廢水提取物是高氨氮和高cod含量的廢水。由于c-c1和化合物的低含量，組成復(fù)雜，水質(zhì)變化較大，已成為水處理研究的難點和熱點。序列生物膜處理器（bsbr）具有sdr和生物膜檢測器的優(yōu)點。序列稅收可提高系統(tǒng)的抗沖擊負荷能力，生物膜確保硝酸菌的長期生存，并促進硝化反應(yīng)。同時，生物膜載體上存在溶解氧濃度梯度的現(xiàn)象，這種好氧、缺氧和同時氧共存的狀態(tài)為直接脫氮環(huán)境提供了良好的環(huán)境，成為新型脫氮器的研究熱點。盡管很多研究者對SBBR脫氮的工藝條件進行了大量研究,但是目前研究者對其脫氮的微生物機理尚不清楚.現(xiàn)代分子生物學(xué)為深入研究各類環(huán)境系統(tǒng)中的微生物提供了先進的技術(shù)手段,目前已有一些文獻報道了利用分子生物學(xué)技術(shù)進行環(huán)境微生物學(xué)研究,但鮮見有關(guān)使用分子生物學(xué)技術(shù)研究脫氮SBBR中微生物群落的研究報道.通過從運行中的反應(yīng)器生物膜提取總DNA,并應(yīng)用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)和DNA測序以及系統(tǒng)發(fā)育分析等新的分子生物學(xué)技術(shù),對SBBR反應(yīng)器中的細菌群落進行研究,以期獲得SBBR反應(yīng)器中細菌組成和功能以及動態(tài)變化規(guī)律,從而為工藝改進提供科學(xué)依據(jù).1材料和方法1.1sbbr反應(yīng)器生物處理SBBR反應(yīng)器中生物膜用長沙市某污水處理廠活性污泥接種,并用長沙市某垃圾填埋場的垃圾滲濾液進行3個月掛膜馴化,反應(yīng)器有效容積為3.0L.SBBR處理工藝的單個運行周期為24h,每天10:00換水,出水量為600mL,進水為300mL滲濾液原水與300mL蒸餾水混合,瞬時進水,瞬時出水;進水完畢,4h曝氣,然后靜置2h,循環(huán)4次.SBBR反應(yīng)器的主要測定參數(shù)為pH、COD和氨氮濃度.本研究共取樣8個,其中,在SBBR反應(yīng)器出水水質(zhì)穩(wěn)定(氨氮去除率>90%)后的1個處理周期內(nèi),從進水完畢,每4h從生物膜取樣1次,每次取樣量約0.3g,共計6個樣品,編號為N1~N6,凍存于-20℃?zhèn)溆?馴化的生物膜取樣1個,編號為N7,凍存于-20℃?zhèn)溆?原水(未經(jīng)稀釋的垃圾滲濾液)10mL以6000r/min離心,沉淀凍存于-20℃?zhèn)溆?編號為N8.1.2sds-pcr法生物膜總DNA的提取與純化采用改進的楊朝暉等的蛋白酶K-CTAB法,采集的生物膜樣品解凍后,加入1.0mLDNA提取緩沖液(0.1mol/LTris-HCl,0.1mol/LEDTA,0.1mol/L磷酸鹽,1.5mol/LNaCl,質(zhì)量分數(shù)1%的CTAB,pH8.0)混合,再加入20μL蛋白酶K(10mg/mL),37℃下,混合液在搖床上225r/min搖動30min;加入150μL10%SDS,65℃水浴2h,每20min輕微顛倒一下;室溫下,9000r/min離心10min,上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中;沉淀中再加入0.5mL提取液和20μL10%SDS;渦旋混合,65℃水浴10min,室溫下,9000r/min離心10min,上清液合并;合并后的上清液與等體積氯仿-異戊醇(24∶1)緩慢振蕩混合至不再分層,9000r/min離心10min,吸取水相(即初提DNA)轉(zhuǎn)移至新離心管中,取5μL以0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測;初提的DNA與0.6倍體積異丙醇混合后沉淀1h以上;室溫下,18000r/min離心20min,棄上清,沉淀以1mL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌;4℃下,13000r/min離心5min;棄上清,沉淀再次洗滌,離心棄上清后自然風(fēng)干;以200μLMilli-Q水(Millipore,USA)重懸沉淀,取5μL以0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測.1.3pcr擴增采用由上海生工合成的細菌16SrDNA通用引物341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)直接對總DNA進行PCR擴增,其中在341F的5′端加有40bp的GC夾(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCG-3′),用于后續(xù)的DGGE.PCR擴增體系為:TaqDNA聚合酶(TianGen,北京)4U,10倍反應(yīng)緩沖液為10μL,其中Mg2+濃度為15mmol/L,dNTP(10mmol/Leach,TianGen,北京)為4μL,引物為1.0μL(20μmol/L),BSA(Amresco,USA)溶液(10mg/mL)為0.5μL,最后加滅菌的Milli-Q水至體積為100μL.PCR反應(yīng)在MyCycler(Bio-Rad,USA)上進行,反應(yīng)過程為94℃變性4min,然后94℃變性40s,55℃退火40s,72℃延伸1min,循環(huán)35次,然后在72℃保持10min,最后4℃保溫.PCR反應(yīng)液使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.1.4pcr產(chǎn)物的電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖進行凝膠電泳,目的條帶用QIAquikGelExtractionKit(Qiagen,Germany)回收,溶解于60μL無菌Milli-Q水中.取30μL純化后的PCR產(chǎn)物在DCodeSystem(Bio-Rad,USA)上進行電泳,變性梯度范圍為30%~60%,聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%,電壓為140V,電泳時間為15h,溫度恒定為55℃.電泳結(jié)束后,凝膠以0.5μg/mL的溴化乙錠溶液染色,洗滌數(shù)次后于GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)(BioRad,USA)上成像檢測.1.5細菌種群豐富度為了解菌種群在SBBR反應(yīng)器中的動態(tài)變化,對DGGE條帶圖譜進行了統(tǒng)計分析,著重討論了各時刻細菌種群的豐富度和相關(guān)性.其中,豐富度分析以圖譜中所有的條帶數(shù)為1,不同時刻樣品的細菌種群豐富度值為該時刻樣品的條帶數(shù)除以圖譜中的總條帶數(shù)(同一位置的條帶只算1條):Rsi=Li/LTRsi=Li/LΤ式中,Rsi為第i泳道的細菌種群豐富度值;Li為第i泳道上的條帶數(shù);LT為圖譜中的總條帶數(shù)(同一位置的條帶只算1條).相關(guān)性分析主要分析不同時刻之間細菌種群的相似性,2條帶之間的相似性系數(shù)可以用Sorenson配對比較相似性系數(shù)(Cs)公式計算:CsAB=2LAB/(LA+LB)×100CsAB=2LAB/(LA+LB)×100式中,CsAB為泳道A和泳道B之間的相似性系數(shù);LAB為泳道A上的與泳道B上位置相同的條帶數(shù);LA為泳道A上的條帶數(shù);LB為泳道B上的條帶數(shù).1.6pcr和同源性分析在紫外燈下切下DGGE條帶,洗凈后浸泡于60μL無菌Milli-Q水中24h以上,取20μL進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)DGGE確認為單一條帶后,送交生物公司(Sangon,上海)測序.測序結(jié)果提交GenBank并獲得接受號.使用GenBank的BLAST對測序結(jié)果進行同源性分析,根據(jù)同源性分析結(jié)果使用DNAStar5.0分析軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹.2結(jié)果與討論2.1反應(yīng)器的水質(zhì)分析SBBR反應(yīng)器馴化結(jié)束后,連續(xù)運行了30d,隔天監(jiān)測出水水質(zhì),主要運行參數(shù)包括pH、COD去除率和氨氮去除率,具體結(jié)果見圖1.取樣時間為運行的第16d,取樣時的水質(zhì)見圖2.從圖1可以發(fā)現(xiàn),反應(yīng)器在運行期間的出水水質(zhì)都達到了很好的出水效果,氨氮的去除率都達到了97%以上,COD的去除率雖然有一定的波動,但始終保持在86%以上.圖2中,0h表示的是進水的水質(zhì)情況,4~24h表示的是反應(yīng)器中的水質(zhì)情況,從圖2可以發(fā)現(xiàn),進水pH約7.8,主要是因為滲濾液經(jīng)過長期的厭氧反應(yīng),產(chǎn)生了有機酸類,將高濃度的氨氮中和,使pH降低,經(jīng)過4h的曝氣后,有機酸類被微生物消耗,同時由于稀釋作用,pH升高到8.74,在后續(xù)處理過程中,pH則隨著氨氮和COD的同時去除而稍有下降.2.2pcr擴增產(chǎn)物初提的DNA和純化后的DNA經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果表明初提和純化后的DNA片段長度均大于23kb,且獲得了較高的量,見圖3(a)和圖3(b).PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖電泳后以EtBr染色,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照,結(jié)果見圖3(c),表明PCR擴增獲得了高量和高特異性的PCR產(chǎn)物,片段長度約為630bp,為目標(biāo)片段長度.2.3菌株在生物膜的生長在GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)下,使用QuantityOneV4.52(Bio-Rad,USA)軟件對經(jīng)溴化乙錠(0.5μg/mL)染色的DGGE凝膠進行成像,在8條泳道上一共觀察到29條不同的條帶,見圖4(a);圖4(b)是根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)的成像照片,經(jīng)過軟件分析和人工分析后繪制的DGGE圖譜示意圖,簡單描述了各條帶的相對強度和分布;有關(guān)豐富度值和相關(guān)性分析的統(tǒng)計分析結(jié)果分別見表1和表2.根據(jù)圖4和表1以及表2,發(fā)現(xiàn)泳道N7中的條帶,除了J和V,在泳道N1~N6中都可以找到,而且N7與N1~N6的Cs值都比較高,這說明生物膜的馴化是比較成功的,在正常運行后生物膜細菌群落沒有發(fā)生很大的變化;條帶J和V是來自接種污泥中的細菌,因為在泳道N8中沒有發(fā)現(xiàn)與其對應(yīng)的條帶;條帶J和V經(jīng)過馴化過程仍存在于生物膜中,但又從正常運行的生物膜中消失,可能是馴化過程采用了比較低的氨氮負荷,正常運行時高氨氮負荷將其最終選擇掉,因為其條帶亮度本來不大,表明其在生物膜中的存在量不大.N8中的細菌多樣性無疑是最豐富的,表1中的Rs值也證實了這一點,這可能是因為在滲濾液貯池這一厭氧環(huán)境中,不僅存在很多有脫氮功能的細菌,同時也存在著大量的厭氧細菌,但是這些厭氧細菌在SBBR運行過程中大多無法繼續(xù)生長,可能是因為pH改變,或是因為間歇曝氣破壞了其生長必需的厭氧環(huán)境,所以圖譜中,N8中的一些條帶,比如K、L、M、N、Q和U并沒有出現(xiàn)在N1~N7中,即使其中某些條帶亮度比較大;而條帶B和C,雖然沒有立即從生物膜中消失,但是經(jīng)過短暫的1~2個曝氣階段后,也從生物膜中消失,由此可推斷條帶B和C代表的細菌對反應(yīng)器運行環(huán)境不適應(yīng),所以無法存活下來;條帶W和c則是例外,它們僅出現(xiàn)于N1~N6和N8中,在N7中沒有發(fā)現(xiàn)對應(yīng)條帶,是何原因造成這種現(xiàn)象的出現(xiàn),還有待進一步研究.N8與N1~N7的Cs不高,這主要是由于N8細菌豐富度較大引起.從圖4(b)中可以發(fā)現(xiàn),無論是馴化后的生物膜還是運行中的生物膜,它們的大多數(shù)條帶都能在N8中找到對應(yīng)條帶,也就是說反應(yīng)器中的生物膜細菌有可能主要來自于滲濾液原水,接種污泥的貢獻并不大,這也為反應(yīng)器微生物馴化提供了一定的參考依據(jù).N1~N6的Rs值都比較小,可能是因為經(jīng)過馴化過程,很多細菌都被比較苛刻的馴化環(huán)境所淘汰掉了,造成生物多樣性下降.N1、N2、N3、N4、N5和N6之間的Cs值很大,尤其是N4、N5和N6之間的Cs值達到了100,可見生物膜的細菌組成在單個運行周期內(nèi)也是比較穩(wěn)定的,這也從另一方面說明馴化是比較成功的,獲得了比較穩(wěn)定的生物膜.2.4同源性分析結(jié)果29條條帶經(jīng)切膠回收、PCR重擴增和DGGE鑒定后,送交測序,一共獲得29條不同的16SrDNA序列,使用GenBank的Sequinwin32將序列提交給GenBank注冊,并獲得接受號(DQ838671~DQ838699),條帶與接受號之間的對應(yīng)關(guān)系見表3.使用GenBank的BLAST程序,將29條序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,獲得各條序列的同源性信息(表3),然后從GenBank得到與其同源性最近的序列,使用DNAStar5.0程序的MegAlign,使用ClustalV方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖5.從表3可以發(fā)現(xiàn),除了條帶D、H和M不能在GenBank中找到與其同源性很高的種群以外,其它條帶基本上都可以找到與其序列同源性較高(>90%)的種群;根據(jù)同源性分析結(jié)果,并結(jié)合3.4節(jié)的討論可以發(fā)現(xiàn),大多數(shù)僅存在于N8中的細菌確為厭氧細菌,尤其是其中竟然有3種(條帶U、M和L)不同的Chloroflexi屬細菌;根據(jù)分析結(jié)果,反應(yīng)器中存在著比較豐富的脫氮種群,但大部分均為硝化細菌和反硝化細菌,包括Nitrosomonas、Hyphomicrobium、Nitrosococcus、Nitrobacter、Nitrospina和Nitrospira等多個屬的菌株以及Bacillusclausii和Pelobacterpropionicus等菌種,具有厭氧氨氧化作用的只有條帶G所代表的Brocadiaanammoxidans,此外,還有條帶B所代表的具有好氧反硝化功能的Hyphomicrobium屬細菌,由此也可以看出,該反應(yīng)器在該工藝條件下,可能同時存在全程硝化反硝化、同時硝化反硝化和厭氧氨氧化3種脫氮形式.圖5(a)代表大部分硝化和反硝化細菌種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,樹圖顯示它們在系統(tǒng)發(fā)育上存在較親近的遺傳關(guān)系,只有Hyphomicrobium屬細菌(條帶B)由于具有好氧反硝化作用,與其他脫氮種群有較遠的親緣關(guān)系.圖5(b)代表反應(yīng)器中除大多數(shù)脫氮種群之外的細菌之間的遺傳關(guān)系,從圖5(b)可以發(fā)現(xiàn),這些細菌由于在生長環(huán)境和代謝機能上的差異比較大,在反應(yīng)器中所起的作用差異也比較大,因而在系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān)系也比較遠;尤其是條帶D和H所代表的菌種,在同源性分析中和系統(tǒng)發(fā)育樹上都難以找到與其親緣關(guān)系比較近的種,而這2種細菌都