抗壞血酸的測定

抗壞血酸的測定

抗壞血酸是一種酸性的自糖衍生物，是一種含有烯醇酸的自酸內(nèi)酯。立體結(jié)構(gòu)與糖類相似，有D型和L型兩種異構(gòu)體，但只有L型有生理功效，可發(fā)生氧化與還原互變。氧化型和還原型都有生物活性。分子中第二、三兩位碳上烯醇羥基的氫容易生成H+而釋出，故抗壞血酸雖然不含自由羥基，仍具有有機酸的性質(zhì)。其分子式如下：抗壞血酸在水中的溶解度為0.3g/ml。熔點190～192℃。PH=4時氧化還原電位E0=0.166V。其電離常數(shù)PK1=4.17,PK2=11.57。最大吸收波長245nm（酸性）與265nm（中性）。在堿性與酸性介質(zhì)中均能迅速被氧和金屬離子氧化成脫氫抗壞血酸（DHAA），脫氫抗壞血酸可進一步氧化成二酮古樂糖酸（DKG）【2】。抗壞血酸（維生素C）是維持機體正常生理功能的重要維生素之一。它廣泛參與機體氧化、還原等復(fù)雜代謝過程。常作為抗氧劑、營養(yǎng)強化劑等添加于食品藥物中。抗壞血酸還能與抗氧化劑的反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)，使氧化劑再生，因而抗壞血酸也是一種重要的抗氧化劑的增效劑【2】。新鮮水果及蔬菜中含有豐富的抗壞血酸，尤其是橙子、橘子、番茄以及鮮棗和松針等含量最豐富【1】。所以抗壞血酸是水果蔬菜中的一項非常重要的營養(yǎng)指標?？箟难嵩谌梭w內(nèi)能促進膠原蛋白和粘多糖的合成，增加微血管的致密性，降低其通透性及脆性，增加機體抵抗力。缺乏時，引起造血機能障礙、貧血、微血管壁通透性增加，脆性增強和血管容易破裂出血，嚴重時肌肉、內(nèi)臟出血死亡，這些癥狀在臨床上通常稱為壞血病?？箟难崾侨梭w所必須的由外界提供的營養(yǎng)物質(zhì)。鑒于抗壞血酸對人類的重要性，近年來發(fā)展了一系列新的測定方法，而且經(jīng)典方法也得到了許多改進。本文對食品、藥物及生物樣品中抗壞血酸的測定方法，如滴定分析法、分光光度法、電化學(xué)法、色譜法等，在最近十幾年的進展進行了總結(jié)。1滴法分析1.1抗壞血酸的測定抗壞血酸分子中的烯二醇基具有還原性，與I2反應(yīng)定量地被氧化生成二酮基。反應(yīng)式如下：1mol抗壞血酸與1molI定量反應(yīng)，故可用于抗壞血酸的定量測定。以淀粉作指示劑，用碘標準溶液滴定至溶液呈穩(wěn)定的藍色為終點，此方法常用作食品或藥劑中抗壞血酸含量的測定。方便實用，但準確度不高，誤差較大【3】。1.22雜質(zhì)干擾和反應(yīng)式的測定抗壞血酸可還原染料2,6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色（在中性或堿性溶液中呈藍色），被還原后顏色消失。還原性抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標準染料液的量，與樣品中抗壞血酸的含量成正比。反應(yīng)式如下：該方法常用于食品、飲料、血清中抗壞血酸含量的測定。其中2,6-二氯靛酚（DCIP）是測定抗壞血酸的標準試劑，該法分析速度快，所需儀器設(shè)備簡單，但DCIP法的局限性在于特效性較差，且染料不穩(wěn)定，許多化合物如酚巰基、丙糖還原酮以及許多離子，如亞鐵離子、亞銅離子、亞硫酸根離子，全能還原此試劑，需要在反應(yīng)前用硫醇鹽除去重金屬離子的方法減少干擾【2】【4】【5】。2分光光度法2.12比色法測定總抗壞血酸含量用活性炭將還原性抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，然后與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色的肼。在濃硫酸的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色的無水化合物———雙-2,4-二硝基苯。在硫酸溶液中顯色穩(wěn)定，最大吸收波長為520nm。吸光度與總抗壞血酸含量成正比，故可進行比色測定。肼比色法測得的是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。肼比色法操作復(fù)雜，特異性較差，易受共存物質(zhì)的影響，結(jié)果包括二酮古樂糖酸，故測定值往往偏高。而且活性炭對抗壞血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧進行界面反應(yīng)，加入量過低，氧化不完全，測定結(jié)果偏低，加入量過高，對抗壞血酸有吸附作用，使結(jié)果也偏低【4】【5】。2.2抗壞血酸含量的測定—金屬離子法方法的實質(zhì)是氧化還原反應(yīng)，是將金屬離子還原，使之產(chǎn)生穩(wěn)定的有色溶液。最通用的是抗壞血酸將Fe(Ⅲ)還原成Fe（Ⅱ），加入螯和劑后，F(xiàn)e（Ⅱ）即顯色，在絡(luò)和物最大吸光處測定吸光度。其吸光值同抗壞血酸的濃度成正比。最常用的Fe（Ⅱ）螯和劑是α，α`-聯(lián)吡啶【6】【7】，2,4,6-三吡啶基均三嗪（TPZ）。該法用于血清中的抗壞血酸和脫氫抗壞血酸含量的同時測定，脫氫抗壞血酸用二硫蘇糖醇還原成抗壞血酸，通過還原前后吸光值的差值對兩種物質(zhì)定量。測定尿樣時需預(yù)先將鐵沉淀，用活性炭處理以除去干擾物【2】?？箟难釋︺~有較專一的還原作用，新銅試劑靈（2,9-二甲基-1,10-菲羅啉），與Cu2+的絡(luò)合作用產(chǎn)生溶解于水的黃色物質(zhì)的原理，建立了新銅比色法測定抗壞血酸【8】。2.3測定抗壞血酸的方法1989年，Muralikrishna等人利用抗壞血酸還原磷鎢釩雜多黃的特性，建立了測定抗壞血酸的方法，國內(nèi)學(xué)者利用雜多酸作為顯色劑體系測定抗壞血酸的方法也進行了研究，與此同時還有，利用磷鉬二元雜多藍測定抗壞血酸的方法【9】；磷鉬鎢三元雜多酸測定抗壞血酸光度法【10】鉬藍比色法測定抗壞血酸【11】等各種雜多酸法。2.4抗壞血酸含量的測定用定量過量的碘酸鉀溶液，在弱酸性條件下，與碘化鉀生成I3-的顯色反應(yīng)，抗壞血酸將一部分I3-還原，剩余的I3-用紫外分光光度計來測得，根據(jù)這些關(guān)系建立了紫外分光光度法測定抗壞血酸【12】。2.5偶氮染料的合成對氨基苯磺酸與亞硝酸根進行重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，抗壞血酸對重氮鹽得分解有催化作用。利用加入8-羥基喹啉與該重氮鹽反應(yīng)生成偶氮染料來終止反應(yīng)。在波長495nm處，用1cm比色皿以水作參比測定其吸光度，吸光度與空白體系的差值ΔA與抗壞血酸的質(zhì)量濃度成線性關(guān)系【13】利用抗壞血酸的吸光度A與濃度C及照射波長之間的關(guān)系，建立了藥物中抗壞血酸的雙波長紫外分光光度測定法【14】。2.7流動注射色譜法檢測抗壞血酸表達在PH2～6的鹽酸介質(zhì)中,抗壞血酸與Fe(Ⅲ)與鄰菲啰啉混合液反應(yīng),生成Fe（Ⅱ）與鄰菲啰啉形成有色絡(luò)合物，其吸光值同抗壞血酸的濃度成正比【6】。將其與流動注射分析(FIA)相結(jié)合,建立的測定抗壞血酸的流動注射(FIA)光度法；抗壞血酸的流動注射分析-2,6二氯吲哚酚光度法可以測量飲料、甜橙、藥片和尿液中抗壞血酸【15】。3熒光化合物的測定樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉。在一定條件下，喹喔啉之熒光強度與脫氫抗壞血酸濃度成正比，反應(yīng)式如下：當食物中含有丙酮酸時，也與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種熒光物質(zhì)，干擾測定。可加入硼酸，硼酸與脫氫抗壞血酸結(jié)合生成硼酸脫氫抗壞血酸螯合物，此螯合物不能與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光化合物；而硼酸不與丙酮酸反應(yīng)，丙酮酸仍可發(fā)生上述反應(yīng)。因此，加入硼酸后測出的熒光值即為空白的熒光值。熒光法受干擾的影響較小，且結(jié)果不包括二酮古樂糖酸，故準確度較高，重現(xiàn)性好，靈敏度同肼比色法基本相同，但操作較復(fù)雜【4】。4脫氫抗壞血酸法抗壞血酸在電極上的氧化遵從一個不可逆的電極機理，失去2個電子和2個氫離子形成脫氫抗壞血酸，然后再經(jīng)過不可逆的水合作用形成脫氫古樂糖酸?？箟难峋哂胁痪坏乃俾食?shù)，因而發(fā)展了許多電化學(xué)分析法。這些方法全是以動力學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)（測定電流、時間及電量）。此方法與2,6-二氯靛酚方法相比，選擇性更好，測定限較低。5氫氧譜法測定總糖含量色譜法包括紙色譜、薄層色譜、氣相色譜和液體色譜法。高效液相色譜法可以同時測得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量，具有干擾少，準確度高，重現(xiàn)性好，靈敏、簡便、快速等優(yōu)點，是上述幾種方法中最先進、可靠的方法。但是在一般實驗室卻受到儀器的限制，不能普及。5.1抗壞血酸的測定早期紙色譜在抗壞血酸測定方面應(yīng)用很多，而且多在顯色方法和溶劑洗脫上進行研究。比如用WhatmanNo1濾紙和酸性KCN區(qū)分抗壞血酸和脫氫抗壞血酸，用浸過偏磷酸的濾紙并用酚-乙酸溶液展開，將抗壞血酸洗脫后用2,6-二氯靛酚或2,4-二硝基苯肼的方法再進行測定等。在定量測定抗壞血酸方面，薄層色譜比紙色譜用的更加廣泛。5.2抗壞血酸化合物盡管氣相色譜在提高有機痕量化合物中的靈敏度和選擇性方面起了很大作用，可是抗壞血酸這種極性化合物不能直接采用這種技術(shù)。為了能用氣相色譜測定抗壞血酸，一般是將其在六甲基二硅氨烷和三甲基氯硅烷（2:1）的吡啶溶劑中進行三甲基硅醚衍生化，增加其揮發(fā)性。5.3衍生化