山仙顆粒對黃曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型動物肝組織形態(tài)學及胎盤型谷胱甘肽-s-轉移酶表達的影響

山仙顆粒對黃曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型動物肝組織形態(tài)學及胎盤型谷胱甘肽-s-轉移酶表達的影響

*咸陽科技計劃支持項目xk0614-2（3）。陜西中醫(yī)學院2005級碩士研究生山仙顆粒作為我院院內制劑在肝癌治療中已使用將近10年,前期的實驗研究及臨床應用證明其在抑制腫瘤及提高患者生存質量方面效果顯著,為此本研究通過復制化學誘導的大鼠肝癌模型,探討其對化學誘導性肝癌的影響作用,旨在研發(fā)高效、低毒或無毒的抗肝癌藥物。1材料和方法1.1材料1.1.1實驗動物清潔級SD大鼠50只,體重120g～160g,雄性,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。1.1.2免疫組織化學染料黃曲霉毒素B1(AFB1)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)均為美國ACROS公司產品,二甲基亞砜(DMSO)為美國Amresco公司產品;GSTpi多克隆抗體(RabbitAnti-GSTpi),工作濃度1∶80,即用型SABC免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒,均由武漢博士德生物工程有限公司生產;山仙顆粒(由西洋參、莪術、山楂、仙鶴草等組成):由陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑中心提供,批號:20051104。替加氟片(FT-207):上海醫(yī)藥(集團)有限公司華聯(lián)制藥廠生產,批號:060603。1.2方法和步驟1.2.1動物模型采用段小嫻等建立的單劑量黃曲霉毒素B1(AFB1)致大鼠肝癌短期實驗模型(AFB1+2-AAF+2/3PH)。1.2.2山仙顆粒的灌胃協(xié)同模型采用完全隨機分組法,每組10只,分別為:空白組(A組):正常飼養(yǎng),不做任何處理。模型組(B組):采用“AFB1+2AAF+肝2/3切除”的肝癌模型,在此期間每日生理鹽水灌胃一次。大劑量山仙顆粒組(C組):造模同上,每日按山仙顆粒10g/kg配制藥液灌胃一次。小劑量山仙顆粒組(D組):造模同上,每日按山仙顆粒2.5g/kg配制藥液灌胃一次。對照組(E組):造模同上,每日按替加氟200mg/kg配制藥液灌胃一次。每籠五只分籠飼養(yǎng)。1.2.3免疫組化染色所有動物每周定期稱體重一次,并隨時觀察進食情況、中毒癥狀及死亡情況。于實驗第6周末各組動物稱重后在10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉下剖腹取出肝臟,于10%(體積分數)福爾馬林溶液中固定24h,脫水、透明、浸蠟,常規(guī)石蠟包埋,行5μm及4μm厚連續(xù)切片,分別行HE染色和免疫組化染色。肝組織形態(tài)學檢查以1987年全國實驗腫瘤病理專題座談會紀要所制定標準進行判定。肝組織胎盤型谷胱甘肽-S-轉移酶(GST-P)免疫組化染色,以石蠟切片采用SABC法進行,以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。結果判定采用形態(tài)學分析軟件JD-801D對GST-P陽性灶定量分析,即測量單位面積內陽性灶的個數(個/cm2)及單位面積內陽性灶的面積(mm2/cm2)。1.2.4統(tǒng)計分析各組數據以均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,所有數據用spss13.0統(tǒng)計軟件處理。2結果2.1對2-aaf飼料一般情況的影響A組動物一般狀況良好,活動正常。造模各組動物一般情況較差,在給AFB1后各組動物均有精神差,食量減少現象,給2-AAF飼料期間,各組動物均有輕度厭食、食量減少現象,其中B組與D組較明顯,體重增長減慢。C組、D組一般狀況較好,體重增長較B組及E組快,其中以C組最明顯。實驗過程中B組2只、E組1只死于肝大部分切除術(PH)術中出血,D組1只PH后未蘇醒,死亡。實驗結束時,造模各組個別動物處死時有腹水及腸梗阻現象。2.2各組大鼠肝臟功能指標的比較表1A組個別輕度充血,余無異常。鏡下所見:個別動物僅見部分肝竇充血。B組肝臟腫脹增大,表面不光滑,表面及切面可見較多散在直徑2～4mm不等的灰白色結節(jié),略隆起。鏡下所見:肝小葉結構受到破壞,肝細胞渾濁腫脹,有水樣變性及點狀壞死,可見核空泡和胞腔空泡,肝竇內見卵圓細胞增生,個別區(qū)域間質細胞浸潤;部分動物肝細胞變性壞死劇烈,出現嗜酸性、嗜堿性、透明細胞灶、混合肝細胞灶及大小不一的增生結節(jié),結節(jié)外肝細胞索消失,細胞排列紊亂、擁擠,可見大量梭形、圓形、卵圓細胞增生,匯管區(qū)小膽管增生,可見少量雙核、核深染、巨核細胞。C組肝臟表面欠光澤,所有動物均未見明顯肝臟腫脹,表面無或少見結節(jié),腹腔內也未見滲出液。鏡下所見:性質上與B組相似,但肝細胞的變性、壞死及卵圓細胞增生均顯著減輕;嗜酸、嗜堿、透明及混合細胞灶顯著減少;無增生結節(jié)出現。D組肝臟略腫脹,表面欠光澤,表面及切面可見散在直徑1～4mm不等的灰白色結節(jié),微隆起。鏡下所見:性質上與B組相似,肝小葉結構亦不同程度受到破壞,肝細胞的變性、壞死及卵圓細胞增生略輕,可見核空泡和胞腔空泡,部分可見嗜酸、嗜堿、透明及混合細胞灶,可見增生結節(jié)。E組肝臟外觀與D組類似。鏡下所見:性質上亦與B組相似,肝細胞的變性、壞死及卵圓細胞增生均較輕;嗜酸、嗜堿、透明及混合細胞灶減少;個別可見增生結節(jié)。2.3兩組積mm2/cm2的比較C組動物肝組織單位面積內胎盤型谷胱甘肽-S-轉移酶(GST-P)灶個數(個/cm2)及灶面積(mm2/cm2)均明顯較B組少(小),差異具有顯著性(P均<0.01);D組及E組動物肝組織單位面積內胎盤型谷胱甘肽-S-轉移酶(GST-P)灶個數(個/cm2)及灶面積(mm2/cm2)雖均較B組少(小),但差異均不具有統(tǒng)計學意義(P均>0.05,見附表。3山仙顆粒對大鼠肝胰腺組織的復制及其限制黃曲霉毒素B1是劇毒物質,其致癌強度比奶油黃大900倍,比二甲基亞硝胺高75倍,可誘發(fā)所有動物發(fā)生肝癌。本研究B組觀察到明顯的肝細胞變性壞死、增生灶(嗜酸性、嗜堿性、透明、混合肝細胞)、大小不一的肝細胞增生結節(jié)及病理性核分裂相等特異性的肝細胞癌前病變,與實驗腫瘤病理標準基本相符,成功地復制了化學誘導的大鼠肝癌模型。C組在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中,與B組相比肝細胞的變性、壞死及增生均明顯減輕,特異性細胞增生明顯減少,未見明顯病理性核分裂相及增生結節(jié)。GST-π(在鼠為P)為一組二聚體蛋白,是谷胱甘肽-S-轉移酶的一種同工酶,屬胚胎型同工酶,廣泛分布于人體組織,與體內生物轉化作用及腫瘤的發(fā)生關系密切。其在正常肝細胞中不表達,而在早期肝癌、肝癌前病變、不典型增生及原發(fā)性肝癌中高度表達,大量資料表明,GST-π(在鼠為P)在肝癌前病變組織及肝癌組織中表達明顯增高,免疫組化染色可在肝臟病變發(fā)生早期檢測到由GST-π(在鼠為P)陽性細胞構成的微小病灶,